编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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在各种非生物胁迫中，水分缺乏和重金属胁迫是限制全球作物产量的重要影响因子。目前的分子方法有助于帮助研究人员研究胁迫相关的关键调控因子，以用于提高作物产量。本研究主要以拟南芥的一个关键调节因子OsMYB-R1进行了研究。拟南芥中OsMYB-R1的表达会提高对PEG，干旱和镉胁迫的耐受性。转录组测序分析表明，OsMYB-R1通过抗氧化系统调节关键基因的表达，这些关键基因可以改善转基因植株的根系结构并维持细胞内稳态。该分析还揭示了应激反应基因和激素应答基因的差异表达，表明转基因植株激活了复杂的防御调节机制。此外，水杨酸（SA）在促进OsMYB–R1高表达植物的生长方面起着重要的作用，而在ABA和MeJA处理后，OsMYB–R1高表达植株没有明显变化。总的来说，OsMYB-R1改善作物，特别是双子叶植物非生物胁迫耐受性的重要因子。
论文ID
原名：Over-expression of rice R1-type MYB transcription factor confers different abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis
译名：R1型MYB转录因子过表达研究转基因拟南芥对不同非生物胁迫的耐受性
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872
发表时间：2020年9月
通讯作者：Debasis Chakrabarty
通讯作者单位：印度勒克瑙CSIR国家植物研究所分子生物学和生物技术处
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2020.111361
实验设计
结果
从水稻基因组数据库中提取了OsMYB-R1（Os06g45890）的完整序列和开放阅读框。OsMYB-R1长度为771个核苷酸，包含256个氨基酸。通过InterProScan进行序列分析表明，OsMYB-R1包含一个SANT/MYB结构域。利用TRIR BLAST分析，发现AT2G02060是OsMYB-R1的同源基因。有趣的是，通过使用Interroscan比较两个同源基因的序列，发现两个基因有很多共有motifs。
进一步分析表明，OsMYB-R1的氨基酸序列与高粱、毛果杨、玉米、拟南芥和短尾水蚤的蛋白质序列具有较高同源性（图1A）。系统发育分析表明，高粱和玉米的蛋白序列具有相关性（图1B）。
图1. OsMYB-R1序列分析。（A）序列比对。（B）OsMYB-R1担心系统发育树。
2 启动子分析表明OsMYB-R1是一个胁迫响应基因
启动子分析表明，对光敏感的各种顺式作用元件、MYBHv1结合位点、防御、应激反应和厌氧诱导主要存在于OsMYB-R1基因的上游区域（图2A）。它还含有顺式作用元件，对茉莉酸甲酯和水杨酸等激素敏感。令人惊讶的是，AT2G02060含有ABA响应顺式作用元件，而缺少茉莉酸甲酯和盐环酸响应顺式作用元件。可能的原因是水稻和拟南芥中这两个基因的胁迫反应机制不同。
此外，在正常条件下对含有OsMYB–R1启动子的转基因拟南芥的组织化学分析表明，uidA在叶、花和角果中的表达（图2B）。在非胁迫条件下，uidA在根和地上部组织中不表达。在转基因幼苗在不同类型的非生物胁迫下处理1h后，与对照组相比，表现出广泛的GUS活性（图2C）。对拟南芥转基因系的体内启动子分析表明，OsMYB–R1是一种胁迫响应基因，因为在幼苗中获得了更高的GUS表达，特别是在干旱、聚乙二醇、甘露醇和盐度胁迫后（图2C）。在缺水条件下，转基因植株的根系中观察到GUS活性，而在对照组，没有观察到GUS活性。qRT-PCR结果与GUS表达的结果一致（图2D）。进一步证明了OsMYB–R1对各种胁迫条件的高度敏感性，可用于主要作物的研究。
图2. OsMYB-R1启动子分析。（A）拟南芥OsMYB-R1启动子区顺式作用元件及其同源物的比较分析。（B）OsMYB-R1启动子诱导GUS在拟南芥不同营养和生殖组织中的表达。（C）组织化学分析。（D）qRT-PCR分析。
3 OsMYB-R1在拟南芥中的转化及阳性转化子的选择
转录因子在各种生物过程中起到调节的作用，有些转录因子也与耐旱有关。之前的研究发现，OsMYB-R1是水稻中的一个应激响应基因。为了研究非生物胁迫下OsMYB-R1基因在外源模型系统中的作用，作者扩增OsMYB-R1并在拟南芥中转化。PCR电泳结果确认了阳性克隆，条带大小为771bp。作者共获得了8个含有OsMYB-R1的拟南芥转基因植株。并进行了qRT-PCR分析，筛选了过表达植株L1,L2和L3并进行功能和生化研究。
4 OsMYB-R1提高了转基因拟南芥在PEG-6000和干旱胁迫下的耐受性
OsMYB-R1在拟南芥的组成性过表达产生了8个转基因株系，选择3个最高表达植株进行功能验证。平板实验结果显示，OsMYB-R1拟南芥转基因株系在20% PEG处理后的表现优于WT，在对照条件下，转基因株系和WT株系均可以正常生长（图3A）。而OsMYB-R1过表达株系在20%PEG处理严重缺水的条件下也能生长，且侧根密集，而WT不能正常生长（图3B）。
此外，模拟盆栽实验也证明OsMYB-R1过表达系可以在严重干旱条件下正常生长。当过表达OsMYB-R1和WT植株暴露于干旱胁迫下，过表达株系在严重缺水条件下能正常生长（图3C）。过表达植株的存活率（图3D）植株高度、角果长度等参数均表现更好。
图3. PEG和干旱胁迫下转基因拟南芥株系和野生型植株的平板和模拟盆栽试验。（A）过表达OsMYB-R1的转基因株系和野生型植株在1/2 MS的控制条件下生长5天，用15% PEG和20% PEG处理18天后拍照。（B）WT和转基因株系在对照组、15% PEG和20% PEG处理18天后的幼苗长度。（C）过表达OsMYB-R1的转基因株系和WT在对照条件下生长15天，再蓄水30天，干旱胁迫。植物恢复7天后拍照。（D）转基因株系相对于WT的存活率。
5 转基因拟南芥过表达OsMYB-R1对铬胁迫和盐胁迫的响应
启动子分析发现OsMYB-R1可以响应多种胁迫，因此作者也研究了其在干旱胁迫之外的其他胁迫的响应。作者发现水稻OsMYB-R1在镉胁迫下表达量上调。此外，水稻OsMYB-R1的异位表达也表明了对镉胁迫的耐受，进一步表明了OsMYB-R1在拟南芥在铬胁迫的响应。因此，作者对转基因拟南芥在镉胁迫下的生长效率进行了检测，发现其比WT的生长效率更好。与过表达株系相比，镉胁迫浓度提高会显著抑制WT植株的生长。盆栽实验进一步表明，过表达植株生长旺盛。而相对于WT植株来说，过表达植株对盐胁迫更加敏感。
6 由于有效的抗氧化机制，转基因拟南芥在干旱胁迫下ROS积累
在干旱胁迫下，抗氧化酶起到了防止植物氧化损伤的作用。对干旱处理WT和OsMYB-R1过表达系进行DAB和NBT染色，分别定位过氧化氢(H2O2)和超氧化物离子(O2−)。DAB染色表明，WT和OsMYB-R1过表达株之间没有显著差异，表明两株植株的H2O2产量都较低(图4A)。而NBT染色表明，WT和OsMYB-R1过表达株有明显变化，表明WT具有较好的超氧化物离子（图4B）。同时测定WT和OsMYB-R1过表达系的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和愈创木酚过氧化物酶(GPX)的酶活性。在对照组中，WT和OsMYB-R1过表达株在抗氧化酶活性方面表现类似。然而，干旱处理21天后，OsMYB-R1过表达株的SOD、过氧化氢酶和GPX活性增加显著（图4C,D,E）。这些结果表明抗氧化酶在保护细胞免受活性氧积累造成的损害中的作用。
图4. WT和OsMYB-R1过表达株的ROS分析。（A和B）对照和干旱胁迫下WT和OsMYB-R1过表达株的DAB和NBT染色。（C）相对SOD活性。（D）相对CAT活性。（E）相对GPX活性。（F）MDA含量。（G）电解液渗透。（H）WT和OsMYB-R1过表达株在对照组和干旱处理21天后茎部脯氨酸含量。
7 转基因株系保持膜的完整性，以防止干旱胁迫中水分流失
在对照和干旱条件下测量WT和OsMYB-R1过表达株幼苗的MDA含量和电解质渗透量等有关膜稳定性的参数，结果发现，OsMYB-R1过表达株MDA含量和电解质渗透量较少（图4F和G）而WT结果正好相反，说明水分缺乏会导致更多的氧化损伤。
另一个需要考虑的因素是在非生物胁迫下处理渗透失衡的脯氨酸等渗透物质的生物合成。OsMYB-R1过表达株的脯氨酸含量相对于WT较高，说明干旱胁迫下过表达株能更好的的维持细胞内渗透压（图4H）。结果表明，OsMYB-R1过表达株主要通过维持细胞内稳态克服体内缺水问题。
8 OsMYB-R1经历水杨酸依赖
启动子分析表明，OsMYB-R1启动子区域存在多种SA和MeJA响应顺势作用原因，而拟南芥启动子区域存在多种ABA响应顺式作用元件。WT和OsMYB-R1在1/2MS的培养基中培养时，分别在L1,L2和L3中添加50μM的SA和50μM的MeJA和8mM的ABA，这三株转基因植株均表现出早熟花期（5A）。在MeJA和ABA处理后，WT和OsMYB-R1过表达株的生长没有明显差异。说明应激反应中，OsMYB-R1基因存在SA依赖。
此外，在SA补充的培养基中，过表达株系生长更好。与WT相比，过表达株系的长度和生物量都有所增加(图5B和C)。结果表明SA对OsMYB-R1过表达植株的生长具有促进作用。
图5. OsMYB-R1经历水杨酸依赖。（A）OsMYB-R1过表达株和WT在1/2培养基中培养5天，添加50μM的SA处理18天后拍照。（B和C）SA处理18天WT河OsMYB-R1过表达株的苗长和生物量。（D）对照组和50μM的SA处理下，对三周的拟南芥OsMYB-R1启动子进行组织化学分析。（D）OsMYB-R1启动子的qRT-PCR分析。
9 其他转录因子家族成员调控OsMYB-R1基因过表达
植物细胞的应激过程主要受一系列转录因子和应激反应基因的调控。WT和OsMYB-R1过表达株的转录组数据揭示了差异表达的转录因子的数量（图6A）。进一步分析，表明在OsMYB-R1过表达株中有很多转录因子家族表达模式都有显著变化（图6B）。图6C展示了各类TF中上调和下调的基因数量。热图进一步展示了差异表达转录因子的表达模式（图6D）。OsMYB-R1过表达株中WRKY，NAC，MYB，C2H2和ERF等转录因子家族丰度较高。
大部分拟南芥的转录因子的家族成员基因在OsMYB-R1过表达株中上调表达，表明OsMYB-R1可能在调控转录本中发挥重要作用。转录组分析结果显示OsMYB-R1过表达株的ARR-1TF和生长素应答基因上调2倍和20倍。之前有研究报道ARR-1 TF介导了植物生长素生物合成基因TAA1的转录调控。有趣的是，在本研究中，作者观察到ARR-1和生长素生物合成基因的转录本数量增加，这可能是促进OsMYB-R1过表达株侧根生长的原因。
At1g45249和AT5G65310的上调表达，与渗透压耐受性的提高和ABA反应的正调节因子有关。也有研究表明MYB在各种胁迫下的作用。此外，MYB转录因子如At1g01060、At5g37260等也有调控开花和昼夜节律的作用。进一步验证了S平板实验中OsMYB-R1过表达株早开花的实验结果。总的来说，转录因子在OsMYB-R1过表达株中复杂的差异表达模式导致了其对非生物胁迫的耐受性。
图6. 与对照相比，OsMYB-R1过表达株中转录因子、应激和防御相关基因表达的调节。（A）在OsMYB-R1过表达株中上调和下调的TF的数量。（B）各类型TF显著差异的基因数量的饼状图。（C）各TF家族上调和下调基因。（D）差异表达的TF的聚类热图。（E和F）OsMYB-R1过表达株与对照组中上调和下调的应激和防御反应基因总数。（G）应激和防御反应相关差异表达基因的聚类热图。
10 应激和防御反应基因在OsMYB-R1过表达株中的差异表达证明了OsMYB-R1在调节应激反应中的作用
应激和防御反应的基因在植物抵抗各种胁迫中起着重要的作用。本研究，作者也对应激和防御相关的差异表达基因进行了研究。与WT相比，OsMYB-R1过表达株中，大多数应激相关的基因高表达（图6E）。然而，WT中防御相关的基因更多（图6F）。在比较非生物胁迫基因和生物胁迫基因时，作者观察到观察到OsMYB-R1基因的生物胁迫基因转录水平更高，表明OsMYB-R1在生物胁迫方面放回重要作用（图6G）。由于防御相关基因在OsMYB-R1过表达株中下调表达，作者发现LEA和Cyt P450家族的基因表达较少（图6G）。相反，一些参与干旱响应的基因高表达（图6G）。已有研究表明玉米自交系在干旱胁迫下也表现出类似的基因的表达模式。此外，GST和过氧化物酶相关的基因表达趋势类似。可能因为GST和过氧化物酶相关的基因必须维持细胞内ROS平衡，这种应激和防御反应基因的动态变化反映了基因组网络和相互依赖的信号通路的复杂性。
11 活跃的激素串扰是OsMYB-R1过表达株非生物胁迫耐受的重要原因
ABA，生长素，JA和SA等植物激素在植物的防御活动中起着重要作用，以保护植物免受潜在的生物和非生物威胁。本研究发现大量激素相关基因的差异表达。作者发现ABA和生长素响应基因显著上调，而负责合成和降解的基因则下调表达。
12 转录组数据验证
为验证转录组数据的准确性，作者筛选差异表达基因进行了qRT-PCR验证。qRT-CPR结果和转录组数据结果表现一致。
结论
总的来说，OsMYB-R1可以调节植物防御机制的各个方面，以使植物在各种胁迫条件下生长。作者对OsMYB-R1过表达株和WT的表型，基因型和生化水平上均进行了研究，均观察到了OsMYB-R1过表达株的积极变化。由于OsMYB-R1的表达，转基因植株可以较好的对抗非生物胁迫。然而，OsMYB-R1的水稻转基因株和拟南芥转基因株在功能上类似。这可能是由于OsMYB-R1基因在单子叶植物和双子叶植物系统中作为启动子的保守功能，并用拟南芥同源基因进行序列分析，表明顺式作用元件和motif区域具有相似性。因此，OsMYB-R1可以作为一种有价值的研究对象进行研究，以揭示复杂的信号转导机制，这种机制可以用于分子育种等各个方面，以增强植物的抗逆性。
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