编译：伊一，编辑：景行、江舜尧。
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论文ID
原名： Comparative transcriptome analyses defne genes and gene modules difering between two Populus genotypes with contrasting stem growth rates
译名：比较转录组分析两种不同生长速率的杨树基因型之间的基因和基因模块差异
期刊：Biotechnol Biofuels
IF：4.815
发表时间：2020年8月
通讯作者：夏新莉，尹伟伦
通讯作者单位：北京林业大学生物科学与技术学院
DOI号：10.1186/s13068-020-01758-0
实验设计
结果
1 与I-214相比，Neva的茎径向生长更快，生物量积累更高
为了比较Neva和I-214之间的生长差异，使用实时直径树木仪器连续测量两种基因型在一个生长季节的茎径向变化。茎的直径每天波动，从6月到9月稳步增加(图1a)。两种基因型表现出不同的生长模式。在6月初(前生长期)，I-214仅表现出轻微的茎干变化，而Neva表现出显著的茎干增加，而没有明显的变化(图1b-d)。在8月初(快速生长期)，两种基因型都有较高的茎生长速率，其茎表现出规律的昼夜收缩和扩张，I-214也显示出比Neva更高的最大日收缩率(MDS)，与I-214更高的蒸腾速率一致(图1e)。到9月底(后生长期)，两种基因型的生长都达到稳定，并且相对稳定。在这个生长季节，Neva表现出比I-214更高的茎径向生长增量和净光合速率(图1f)。两种基因型的茎含水量(SWC)随着茎的生长而降低。Neva显示SWC比I-214低，表明干生物量积累较高(图1g)。不同节间的切片显示，从顶点开始的第4、7和10节间，Neva的木质部细胞分别比I-214多。木材化学成分分析显示，Neva茎中的木质素和葡聚糖含量高于I-214。
图1.生长较快的Neva与对照I-214的生理比较。a 这两种基因型的茎半径在6月至9月间的变化，是用点树状仪测量的。b 来源于两种基因型前生长期、快速生长期和后生长期的代表茎干。c 两种基因型在三个生长阶段的茎径向日生长量。d 两种基因型在三个生长阶段的最大日收缩量。e 两种基因型在三个生长阶段的蒸腾速率。f 两种基因型在三个生长阶段的最大净光合速率。g 两种基因型在三个生长阶段的茎相对含水量。
2 不同生长时期和基因型杨树形成层的转录组差异
为了解释不同生长速率的两种杨树基因型在整个年度生长期间的转录组差异，研究者构建了18个基因表达谱（在三个生长阶段各有三个重复）。移除低质量和多匹配的reads后，Illumina平台从每个库中生成了220万至870万个clean reads。Clean reads比对到到毛果杨参考基因组上获得170万至530万个reads可以用于进一步详细研究不同生长阶段的样品中的基因表达。总的来说，Neva (33，622)和I-214 (33，624)的所有生长阶段中鉴定出34，937个基因，占杨树基因组（41，335）基因84.52%。
为了了解两种基因型在生长期转变过程中基因表达的变化，研究者确定了一个时间点和前一个时间点之间的差异表达基因。这些基因表示在生长期间I (前生长期到快速生长期)和生长期间II (快速生长期到后生长期)基因表达的转变(图2a，b)。为了进一步阐明生长期生物过程的调节变异，研究者对这些基因进行GO功能分类。在Neva生长期间I，779个上调的DEG大部分富集于细胞大分子代谢过程(GO:0044260)、含核碱基的化合物代谢过程(GO:0006139)和细胞成分组织或生物发生(GO:0071840)。2329个下调的DEG大多涉及代谢过程(GO:0008152)和对刺激的反应(GO:0050896)。在间期II，代谢过程和对刺激的反应具有大部分的4275个上调基因，生物调节和细胞成分组织或生物发生丰富了许多下调基因。在I-214间期I中，上调的基因主要富集在大分子代谢过程(GO:0043170)和细胞成分组织或生物发生中，而下调的基因参与对刺激的反应和生物调节。在间期II，许多受调控的DEG聚集在代谢过程和对刺激的反应中，下调基因在生物调控和细胞成分组织或生物发生中富集，与Neva相同。
此外，基因型-依赖性DEG分析表明，两种基因型在三个生长阶段分别有1542、2295和2110个DEG(图2c，d)。生长阶段基因表达水平的比较揭示了在快速生长阶段基因表达的大量重编程，在I-214中有更多的DEGs上调。GO富集分析用于功能注释。在前生长期，生长快的Neva在细胞壁相关生物发生过程中(GO:0009832、GO:0009834、GO:0042546、GO:0071554和GO:0071669)的基因富集，特别是在木质素(GO:0009808和GO:0009809)和纤维素(GO:0030243)的生物合成过中。相比之下，更多的基因主要聚集在I-214的应激和防御反应过程中(GO: 0006950、GO:0006952和GO:0050896)。当进入快速生长阶段时，Neva的DGE富集在几种受体蛋白信号(GO:0007167和GO:0007169)，多胺生物合成过程(GO:0006595和GO:0006596)中。I-214的DEG除了富集在刺激(GO:0050896)和防御反应外，还富集在几个细胞壁生物发生过程(GO:0009834和GO:0042546)。直到生长后期，Neva在昼夜节律过程中富集了更多的基因(GO:0007623，GO:0042752，GO:0048511)。在I-214中，一些涉及对光反应(GO:0009765，GO:0009768，GO:0015979)以及应激和刺激反应的基因较多(图2e)。对杨树2581个转录因子的注释，分别在生长前、快速生长和生长后阶段鉴定出99、153和172个差异表达的转录因子。 MYB、bHLH、Homeobox、NAC、AP2/ERF、C2H2和MADS基因构成了较大的比例。转录因子的每个基因家族在不同的生长阶段都有不同的表达模式。然而，一些例外如Homeobox(Potri.009G009900)、MYB (Potri.003G144300)、MADS (Potri.003G170000)、NAC (Potri.014G075900)和C2H2 (Potri.014G134400)家族成员在所有三个生长阶段的快速生长基因型中具有相同的上调模式。
图2.不同生长阶段两种基因型Neva和I-214的差异表达基因。a 两种基因型在生长间期I(从前生长期—快速生长期的过渡)和生长间期II(从快速生长期—后生长期的过渡)的差异表达基因。b 韦恩图显示了两种基因型在生长间期I和II的基因表达。c 两种基因型在三个生长阶段的差异表达基因。d 韦恩图展示了两种基因型在三个生长阶段的差异基因。e 在前生长期、快速生长期和后生长期富集的差异表达基因的GO注释。外圈显示了差异表达基因对数功能函数每个GO项的散点图。红点表示上调基因，蓝点表示下调基因。内圈显示了一个z-score，它表示某个GO术语更有可能减少(蓝色)或增加(红色)的提示。
3 共表达网络揭示与细胞生长和细胞壁生物合成相关的基因模块
为了进一步展示整个生长期转录模式的全局视图，使用加权相关网络分析来定义在整个生长季节在两个重复中变化的共调节基因的簇(模块)。模块最初的特征是基因互连和通过合并表达谱相似的相邻模块进行重新计算(图3a)。最终检测到总共18个模块具有高度相似的表达，最小模块大小为400。它们被分配了单独的颜色，并通过分层聚类分析和所有模块组合之间的相关性被分为四类(图3b)。
为了阐明两种基因型在生长阶段基因表达的变化，研究者构建了每个模块的表达谱(图3c)。每个模块的特征基因值显示，生长阶段转录水平的变化是确定基因共表达模块的主要因素，其次是基因型。18个模块显示了两种基因型在不同生长阶段的不同表达谱。 cluster I，由青色、灰色60、浅青色和黄色组成，其中基因的表达在后生长阶段在Neva中增加。cluster II，由橙红色、暗红色、午夜蓝和棕褐色模块组成，在Neva前生长阶段出现了的特征基因有较高表达值。为了确定与测量的生理特征最密切相关的模块，研究者将总结模块概况的特征基因与外部特征相关联，以寻找最显著的关联。计算每个基因模块和表型性状之间的相关性。有趣的是，在每个特征与至少一个模块存在显著的相关性(图3d)。例如，红色模块与基因型性状高度相关，且在整个生长期在两种基因型中显示出显著不同的基因表达。该模块中的基因根据它们与基因型和模块成员的相关性的显著性(一个模块中基因连接性的值)进行散点图绘制，红色模块中的转录因子标记在图上(图3e)。转录因子C2H2锌指蛋白(Potri.014G134400)在慢生长I-214中的三个阶段均呈正相关。相反，负相关最高的转录因子Homeobox BELL 基因(Potri.009G009900)在快速生长Neva的整个生长期表达较高。
为了便于生物学解释，鉴定模块为对特定GO类别具有显著的功能富集(图3f)，以进一步关注模块的功能特性。一些与茎的发育和生长相关的重要过程集中在不同的模块中。蓝色模块中GO注释与表达最多的基因(9714)体现了许多与细胞周期和分裂相关的过程，如DNA代谢过程(GO:0006259)、染色体组织(GO:0051276)、核分裂(GO:0000280)、细胞器组织(GO:0006996)和细胞骨架组织(GO:0007010)。蓝色模块的特征基因表达水平随着生长时间的增加而增加，在快速生长阶段达到峰值，在后生长阶段下降，这显示了两种基因型中表达的平行变化趋势(图3c)。Neva的模块特征基因表达高于I-214。基于模块成员和表达谱与相应模块特征基因的接近度来选择中心基因。在前生长阶段，DNA结构修饰和复制的过程聚集了更多的上调基因。特微染色体维持蛋白基因（MCM；Potri.001G07400)和复制蛋白A基因(RPA；Potri015G057300),这两个枢纽基因在Neva中上调且具有较高的模块成员，与DNA复制有关。膜受体信号在快速生长阶段得到改善，这是由大量上调的富含亮氨酸的重复蛋白激酶和高模块成员的存在所支持的。在后生长期，细胞活动的大量负调节，如细胞器组织和细胞周期相关过程显示出许多DEG。I-214中表达的差异表达基因上调更多。结果表明，生长较快的Neva在生长期间表现出细胞活性增强，并在该时期结束时负调节—延缓细胞活性，以提高生长速度。
该模块丰富了细胞壁生物合成和碳水化合物代谢的GO术语。在棕褐色模块中的1006个基因中，253个基因的大部分在前生长期显著上调。这些DEG富集在一系列与细胞壁组织和生物发生相关的过程，如木质素、半纤维素、纤维素和果胶的代谢和生物合成，以及多糖的生物合成。在这些DEGs中，检测到25个转录因子基因，其中大多数具有高度的连接性（表1）。这些转录因子主要包括MYB(7个基因)、Homeobox(6个基因)和MADS(3个基因)家族基因，据报道它们参与植物的生长和发育。根据连接性排列，该模块的前10个中心基因包括两个转录因子MYB基因MYB85 (Potri.015G129100)和Homeobox(KNOX)基因PoptrKNAT (Potri.001G112200)。在由几个顶端中心基因组成的基因共表达网络中，一个 COBRA-like IRREGULAR XYLEM(IRX)蛋白基因IRX6 (Potri.015G060100)与MYB85和PoptrKNAT共表达。IRX参与了次生细胞壁生物合成，改变了纤维素和细胞壁多糖的水平。四个纤维素合成酶(CESA)基因(Potri.006G181900，Potri.018G103900，Potri.004G059600和Potri.011G069600)，两个纤维素合成相关的TRICHOME BIREFRINGENCElike(TBL)蛋白基因(Potri.008G069900和Potri.010G187600)，和一个木质化相关的漆酶(LAC)基因(Potri . 010g 18355)在这个共表达网络中呈现出高度的连通性。另外，两个钙相关蛋白基因 cyclic nucleotide-gated channel(CNGC；Potri.017G089900)和 calcium exchanger(CAX; Potri.001G251200）显示出与CESA和IRX基因的高共表达模式。这些基因在生长较快的Neva中均上调，有助于提高次生细胞壁生物合成和多糖沉积。
图3.基因型Neva和I-214在不同生长时间点茎中表达基因的基因共表达网络分析。a 所有表达基因的聚类谱系图以及指定的模块颜色。b 模块之间的相关性。每行和每列对应一个模块特征基因。该表根据颜色图例通过相关性进行颜色编码。c 特征基因在模块中的表达模式。d 模块—特征基因关联。每行对应一个模块特征基因，每列对应一个特征。每个单元格包含相应的相关性和p值。该表根据颜色图例通过相关性进行颜色编码。e 红色模块中基因型与模块成员的基因显著性散点图。 在该模块中，GS和MM之间存在高度显著的相关性(Cor = 1，p < 1e-200)，说明与基因型性状高度显著相关的基因也是与该性状相关的模块中最重要的元素。红色的点代表转录因子，灰色的是红色模块中的其他基因。f 从细胞壁、激素、碳水化合物代谢、细胞活性、运输、光以及防御和应激反应等方面对转基因模块中基因进行富集的热图。
4 BELL转录因子参与了次级导管组织的建立
为了研究杨树形成层转录谱鉴定的基因的意义，研究者通过过表达和CRISPR/Cas9诱导的敲除突变来探索单个基因的潜在功能。从Neva (Genbank登记号为KY423502)克隆了一个BEL1样同源结构域(BELL)转录因子基因PeuBELL15，即毛白杨PtrBELL15 (Potri.009G009900)的直系同源物。该基因全长2436 bp，编码811个氨基酸残基，预测分子量为1501.428 kDa，等电点为6.3。蛋白质比对显示了不同物种的BELL蛋白中的三个保守基序，包括PeuBELL15(图4a)。全基因组调查研究了35个杨树TALE基因，包括20个KNOX和15个BELL家族成员。杨树和拟南芥TALE因子之间的系统发育分析显示BLH8/PNF (At2g27990)和PeuBELL15之间的密切关系(图4b)。PeuBELL15基因在Neva的整个生长季节都表现出较高的表达水平(图4c)。组织特异性表达分析显示PeuBELL15基因主要在茎和冠顶表达(图4d)。
图4. peu bell 15的表达模式和系统发育关系。 a 来自不同物种的BELL基因的蛋白质序列比对显示了三个保守域。这些BELL基因来自欧美杨(PeuBELL15)、毛果杨(Potri.009G009900)、拟南芥(AT2G27999)、紫柳(SapurV1A.0049s0270)、蓖麻(29638.m000515)、木薯(Manes.11G148000)、可可(Theobroma cacao)(The C1G 042098)、葡萄(GSVIV 010)。b 杨树和拟南芥中贝尔家族基因的系统发育关系。c 新疆杨15在不同生长阶段的差异表达谱。d 银白杨15的组织特异性表达模式。
在本研究中，研究者利用CRISPR/Cas9系统编辑了杨树克隆717无性系中PeuBELL15直向同源序列的基因组序列。设计了两个导向RNA (gRNA)，目标是第一个外显子位点(图5a)，以改变阅读框架。测序结果显示，这两个gRNAs通过碱基缺失或插入成功地修饰了靶位点，并且它们产生了双等位基因突变(图5b)。单碱基插入和缺失的突变模式在大多数情况下发生，并且在许多事件中等位基因之间indel模式不同。
图5. CRISPR/Cas9系统介导的杨树BELL15靶向突变。a 来自BELL15杨的CRISPR导向核糖核酸的靶位示意图。b CRISPR/Cas9系统诱导的15号杨两个靶位的诱变。
图6. 杨树PeuBELL15失调引起的茎解剖变化。a 野生型、oxPeuBELL15和BELL15突变体植物茎的横切面。b 第七节间的木质部纤维成分。c 第七节间的导管分子。d 第七节间的导管大小。d-f 野生型、oxPeuBELL15和BELL15突变体植物韧皮部纤维的韧皮部纤维和平均细胞数。 e 野生型、oxPeuBELL15和BELL15突变体植物的木质部细胞档案。
虽然PeuBELL15过表达(oxPeuBELL15)和CRISPR/Cas9介导的突变体(bell15c1/c2)都没有表现出与对照植物(WT)显著的形态差异，但是茎的横切面显示PeuBELL15过表达促进了次级血管组织成分的建立(图6a)。导管组织从初生到次生生长的过渡是从茎尖到底部，切片用甲苯胺蓝染色。在第四节间，野生型植株向二次生长过渡，在形成层区形成细胞档案。在oxPeuBELL15植物中，次生韧皮部和木质部细胞已经产生，并且次生木质部细胞的连续环出现。此外，在次生木质部细胞和韧皮部纤维中发现早熟木质化。到第七节间，更多的次生木质部出现在oxPeuBELL15植物中，以增加细胞档案层，以及不同的木质化韧皮部纤维。而与之匹配的野生型植物只显示出一个连续的次生木质部环。没有高度木质化的韧皮部纤维处于同一发育阶段。此外，oxPeuBELL15中的木质部纤维成分比WT中的多。导管成分没有显著增加，但在oxPeuBELL15中较窄。与野生型植物相比，突变bell15-c1/c2植物呈现出更少的纤维成分和更宽的导管成分(图6b-d)。在茎的底部，髓的结构、次生木质部的连续层、形成层带、具有外围韧皮部纤维的次生韧皮部、皮层和外表皮都存在于植物中。oxPeuBELL15植物有更多的次生韧皮部纤维(图6e-f)和次生木质部的细胞层(图6g)。木材化学成分分析显示葡聚糖和木质素含量显著增加，但木聚糖在过度表达的植物中没有增加(表2)。基因表达分析表明，纤维素合成酶CESA4、CESA7和CESA8的杨树直系同源物在oxPeuBELL15植物中上调。参与木质素生物合成的基因的直系同源物，包括肉桂酸4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)、咖啡酰-COa O-甲基转移酶1(ccaomt 1)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)也上调。其他与次生细胞壁发育相关的诱导基因有IRX、β-扩张蛋白(EXPB)和类纤维束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白(FLA)(图7)。总之，PeuBELL15的过表达改善了次生细胞壁成分葡聚糖和木质素的生物合成，并通过调节相关生物合成基因的表达促进了次生导管组织的建立(图8)。
表2. 过表达植物茎的化学成分分析。
图7.由PeuBELL15表达介导的与次生细胞壁发育相关的基因表达谱。
结论
欧美杨杂种无性系的快速生长使其成为木材和生物燃料生产的重要树种。形成层细胞的动力产生了次生维管组织，并使木本植物的茎径逐年增大。本研究比较了快速生长基因型Neva和对照I-214的形成层转录谱，发现转录组修饰和茎径向尺寸生长率变化之间的关系。在生长季节，Neva在生长前期和快速生长阶段表现出更强有力的细胞周期和分裂事件，导致更多的茎径向积累。同时，发现一种BELL转录因子PeuBELL15在改善导管发育中起积极作用。成熟导管结构的早期建立更有助于物质运输甚至信号转导。因此，它促进植物生物量的快速生长和积累。一般来说，维管形成层细胞分裂和扩张越活跃，木质部细胞的次生细胞壁沉积越多，次生维管组织建立越早，导致茎径向增量和生物量积累越多。这些与维管发育和生长相关的有趣基因将成为定向精英育种的目标，重点是木材生物量的积累。
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