编译：微科盟伊一，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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辣椒是具有经济价值的重要园艺作物之一，越来越多的花色品种已经上市。紫辣椒因其富含花青素而在消费市场上越来越受欢迎。为了研究花青素积累的分子机制，通过qRT-PCR和RNA-Seq检测了绿色和紫色品种果皮中花青素生物合成相关基因的差异表达。这些结果表明CaANT1、CaANT2、CaAN1和CaTTG1参与了辣椒花青素的积累。进一步的研究表明，CaANT1、CaANT2、CaAN1和CaTTG1可以通过形成新的MMBW转录复合物来激活花青素的积累。
论文ID
原名：Anthocyanin Accumulation and Transcriptional Regulation of Anthocyanin Biosynthesis in Purple Pepper
译名：紫辣椒花青素积累及生物合成的转录调控
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2020年10月
通讯作者：解巧利，陈国平
通讯作者单位：重庆大学生物工程学院
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c02460
实验设计
结果
1 紫、青椒花青素成分分析
本文以紫辣椒和青椒为研究对象(图1a)。辣椒果实的颜色是由植物色素产生的，花青素通常被认为是紫色的原因。用HPLC测定了紫色(Co62号)和绿色(Co64号)两个品种的果实色素，结果表明，根据LC−MS分析(图1c)，Co62号果皮中的紫色是由于花色素苷的积累，包括翠雀花苷3-对-香豆酰基-芸香苷-5-葡萄糖苷和翠雀花苷-3-顺香豆酰基芸香苷-5-葡萄糖苷，而Co64号果皮中没有发现花色素成分。进一步分析表明，飞燕草素-3-对-香豆酰基芸香苷-5-葡萄糖苷(5.56 mg/g干重)的含量略高于飞燕草素-3-顺式-香豆酰基芸香苷-5-葡萄糖苷(4.76 mg/g干重)(表1)。
表1.两个辣椒品种(绿色和紫色)（n=3）的花青素含量。
表2.紫辣椒品种(浅色和深色)（n = 3 ）花色素含量。
2 紫、青辣椒花青素生物合成途径结构基因的表达
为了探索辣椒花青素生物合成的分子机制，采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术，在青椒和紫辣椒果皮中检测到花青素生物合成基因CaPAL、CaC4H、CaC4H、CaCHS、CaCHI、CaF3H、CaF3h、CaF3h′H、CaF3′5′H、CaDFR、CaANS和CaUFGT(图2)。不出所料，绿色辣椒和紫色辣椒中Ca4CL、CaC4H、Ca4CL、CaF3H和CaANS的表达水平差异不大，而CaChH、CaCHI、CaF3h、CaF3h、CaF3h、CaUFGT的转录本在紫色辣椒中表现出显著的上调作用。与以前的研究相一致，这些结果表明EBGs的基因表达不是导致花青素生物合成的原因，花青素产生的原因是LBGs的差异基因表达。
图2.两个辣椒品种果皮花青素合成基因的相对表达水平分析。x轴代表不同辣椒品种的果皮，y轴代表相对表达水平。绿色代表Co64号，紫色代表Co62号。误差线代表平均值的标准误差(n = 3)。品种间差异的统计显著性通过成对组比较用单因素方差分析确定。不同字母间有显著差异(LSD，p < 0.05)。
3 利用RNA-Seq对紫、青椒进行转录组分析
为了鉴定导致辣椒花青素积累的关键基因，采用RNA-Seq分析差异基因表达。花青素合成的差异基因表达与qRT-PCR结果一致。相关性分析表明，两个样本的转录水平大致相似。从火山图的结果来看，共有5187个转录因子上调，其他1947个下调(图3a)。为了进一步了解生物系统的功能，将差异表达基因(DEGs)映射到KEGG数据库。如图3b所示，根据功能差异，DEG分为五大类和三十三个子类。细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理以及新陈代谢和生物系统都极大地丰富了DEGs。此外，大量的DEG富集在其他次生代谢物和其他密切相关亚类的生物合成中。为了进一步表征，将研究重点放在了GO的生物过程上(图3c)。根据上述结果，推测一些转录因子的差异表达导致紫辣椒花青素生物合成基因的显著上调。综上所述，绿色和紫色之间有许多DEG，但其中许多可能是由物种差异引起的，只有少数deg可能与花青素生物合成有关。
为了确定花色素苷产生的关键因素，用定量聚合酶链反应筛选差异表达的花色素苷，因为在茄科植物中，MBW复合物经常被发现能调节EBGs和LBGs的表达。在辣椒的RNA序列数据库中，有67个根据其结构或功能特征被注释为MBWs(支持信息excel 3)。通过与其他茄科植物的比较和特异性表达分析，鉴定出了两个与花青素相关的MYB(caan t1和CaANT2)、一个bHLH (CaAN1)和一个WD40 (CaTTG1)转录因子。紧接着，选择四个MBW基因，包括染色体1、染色体2、染色体1和染色体1进行定量逆转录聚合酶链反应。如表3和图4所示，在紫辣椒果实中CaANT1、CaANT2和CaAN1的表达显著上调，CaTTG1的表达在绿辣椒和紫辣椒之间没有显著变化。
图3.DEGs、KEGG和GO分析。（a）火山图。横轴是不同组样品中基因差异表达的倍数变化(对数(B/A))值，纵轴是统计显著性水平，p值代表基因表达的变化。得到的p值越小，结果越显著。散点图中的每个点代表一个基因；红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示无差异表达。（b）组装差异基因的KEGG分类直方图。（c）组装差异基因的GO分类直方图。横轴是功能分类，纵轴是分类中的基因数(右)和注释上的基因总数的百分比(左)。不同的颜色代表不同的分类:直方图和坐标轴上的浅色代表差异基因，深色代表所有基因。
表3 .差异基因表达分析。
4 光、暗条件下花青素相关基因的表达分析
为了进一步验证这些候选MBW基因是否与花青素生物合成有关，设计了紫色果实的光照和黑暗处理进行实验。在遮荫胁迫下，肉眼可见的花青素色素积累较少(图1b)，花青素含量明显低于光照下(表2)。
与光处理相比，在暗处理的果实中，花青素生物合成途径的大部分结构基因被显著下调，除了CaCHI、CaF3H和CaANS(图5a)。接下来，观察了暗处理后候选MBWs的转录水平。事实上，所有候选的MBW基因，包括CaANT1、CaANT2、CAANT 1和CaTTG1，在黑暗处理的水果中都有显著的下调(图5b)。结合以前的研究，本研究表明CaANT1、CaANT2、CaANT 1和CaTTG1通过形成复合物参与调控花色素生物合成途径的结构基因的表达。
图4.两个辣椒品种果皮花青素生物合成相关调控基因的相对表达水平分析。x轴代表不同辣椒品种的果皮，y轴代表相对表达水平。绿色代表Co64号，紫色代表Co62号。误差线代表平均值的标准误差(n= 3)。品种间差异的统计显著性通过配对分组比较用单因素方差分析确定。不同字母间有显著差异(LSD，p < 0.05)。
图5.光暗条件下紫色品种花色素相关基因的相对表达水平分析。(a)花青素合成基因的相对表达水平分析。（b）花青素调节基因的相对表达水平分析。x轴代表不同的治疗方法，y轴代表相对表达水平。误差线代表平均值的标准误差(n= 3)。品种间差异的统计显著性通过配对分组比较用单因素方差分析确定。不同字母间有显著差异(LSD，p < 0.05)。
5 蛋白-蛋白相互作用
花色素生物合成受MBW复合物调控，该复合物由相同的bHLH和WD40转录因子组成，但具有不同的MYB。研究者构建了三种诱饵(CaANT1、CaANT2和CaAN1)来测试与作为猎物的CaTTG1的相互作用。酵母双杂交筛选的结果表明，所有这三种蛋白质(CaANT1、CaANT2和CaAN1)都可以与CaTTG1蛋白质相互作用(图6a-c)。为了探索这两个MYB是如何工作的，诱饵CaANT1被构建来测试与作为猎物的CaANT2的相互作用。出乎意料的是，两种蛋白质可以在酵母双杂交分析中发生物理相互作用(图6d)。为了验证这些结果，研究者进行了体内BiFC分析。该结果也与酵母双杂交实验的结果一致(图7)。
图6.酵母双杂交分析。(a) CaANT1与酵母细胞中的CaTTG1相互作用。(b) CaANT2与酵母细胞中的CaTTG1相互作用。(c) CaAN1与酵母细胞中的CaTTG1相互作用。(d) CaANT1与酵母细胞中的CaANT2相互作用。在合成确定的四重缺失(SD QDO)培养基(左)上，通过在酵母细胞已经被筛选并且在SD双缺失(SD DDO)培养基(右)上具有正生长之后测量酵母细胞生长状态来检测蛋白质相互作用(QDO缺乏His、Leu、Ade和TrpDDO缺少色氨酸和低浓铀。pGADT7-T和pGBKT7-Lam，阴性对照。pGADT7-T和pGBKT7-53，阳性对照。四列(从左到右)对应于四个浓度梯度(1、0.1、0.01和0.001)。
图7.BiFC分析。用空载体浸润作为阴性对照。DAPI染色标记细胞核。合并表示增强荧光蛋白和DAPI的合并图像。
讨论
紫色茄果类蔬菜，包括胡椒、茄子、西红柿和土豆，因其诱人的颜色、抗氧化功能和抗衰老作用而越来越受欢迎。花色素苷的合成和积累是辣椒产生紫色果实的主要原因。根据以前报道的研究，翠雀花素是在辣椒中发现的唯一花色素苷。在本研究的样品中，通过液相色谱-质谱发现了两种花色素苷。辣椒中的花青素沉着受花色素苷生物合成途径的结构基因表达的影响(图8)。F3′H和F3′5′H是花色苷多样化的主要酶，它们决定花色苷的B环羟基化模式，从而决定花色苷的颜色。在该模型中，矢车菊素和飞燕草素的合成分别来自F3′H和F3′5′H的表达。由于花色素苷结构基因如CaCHS、CaCHI、CaF3H、CaF3h′H、CaF3h′5′H、CaFDR和CaUFGT的低表达甚至不可检测的水平，它们在青椒中没有引起花色素苷的形成。此外，CaF 3′H和CaF 3′5′H的特异表达可能导致了与以往报道不同的花色苷种类。
在花色素苷生物合成的这些结构基因中，一个单一的MYB转录因子可以激活EBGs的表达，而由MYB、bHLH和WD40转录因子组成的三重复合物是调节LBGs的关键因子。在其他双子叶物种中，EBGs和LBGs的表达是花色素苷合成途径中不可或缺的。最后，根据RNA-seq和同源性筛选出四个转录因子CaANT1、CaANT2、CaAN1和CATTG 1。根据RNA-seq的结果，在紫辣椒中，除CaTTG1外的所有转录因子均显著上调。一般来说，WD40转录因子的表达水平几乎不随花色素苷的积累或结构基因转录水平的改变而改变。此外，WD40蛋白只为MBW复合物提供了稳定的结构。为了进一步验证候选转录因子和辣椒花色素苷生物合成的结构基因之间的关系，通过qRT-PCR仔细分析了暗处理下上述基因的转录水平。因此，在暗处理下，果实中花色素苷的积累较少，四种候选转录因子和大部分枸杞多糖的表达水平较低。从以前的研究和本研究结果来看，研究者认为花色素苷是通过MBW复合物合成的，该复合物包括CaANT1、CaANT2、CaAN1和CaTTG1，并调节紫色辣椒中枸杞多糖的表达。
MBW复合物可以调节花青素生物合成途径的转录。调控复合物通常是由激活子MYBs与bHLH和WD重复蛋白相互作用形成的。酵母双杂交的结果表明，CaANT1和CaANT2都与bHLH和WD重复蛋白相互作用形成调控复合物。在最近的研究中，调节复合物不仅仅是简单的MBW复合物，而是WMBW复合物，其中WRKY因子和MBW复合物一起调节花青素生物合成途径。在这些先前的研究中，ANT1和ANT2基因已经证明这两种因子都是花青素合成所必需的，并且对NILs外稃和果皮中ANT基因的qRT-PCR分析揭示了基因之间发生一些相互作用；51AN1is是促进花青素生物合成的调节基因，编码R2R3MYB转录因子；TTG1与bHLHs一起稳定MYB-BHLH复合物，调节多种生理过程，如花色素苷和原花色素生物合成。鉴于上述信息，研究则推测该调节复合物是辣椒中的一种新结构，其包含四种蛋白质:CaANT1、CaANT2、CaAN1和CaTTG1。最后，研究者通过活体BiFC实验对其进行了进一步验证。因此，本研究提出了一种新的调控复合物，从分子水平上阐明了具有代表性的紫辣椒品种果皮特异性花青素的积累(图9)。综上所述，本研究为今后花色苷合成机理的研究提供了良好的基础。
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