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炎症性肠病（IBD）如克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是复杂的疾病，其表型和病程差异很大。影响疾病表现和行为的最突出的因素是发病年龄，特别是在年龄小于6岁的儿童中表现出明显的差异。年龄较大的儿童占儿童期发病的IBD的绝大多数，表型和疾病行为与成年期发病的IBD更相似。然而，研究者对导致与IBD发病年龄相关的表型差异的因素的了解仍然有限，例如受影响的细胞类型和涉及的特定分子机制。越来越多的证据表明表观遗传机制（例如DNA甲基化）在调节CD8+T细胞功能的基本方面（包括增殖，活化和T细胞衰竭）中起着重要作用。为了探究CD8+T细胞与炎性肠病的关系，研究者招募了131名新诊断（未治疗）IBD（n=112）和非IBD对照（n=19）的儿童，并从外周血样本中分离的CD8 + T细胞。从诊断开始对所有患者进行至少18个月的随访，并记录详细的临床表型以及结果和治疗数据。此外，每三个月间隔从一组患者中获得纵向样本（n = 62个样本）。研究者共产生了193个CD8+细胞转录组和66个DNA甲基化组，并着手分析这些数据集，以识别患者之间的差异以及与临床结果的潜在相关性。研究者发现，以往报道的CD8+T细胞预后表达和衰竭的标记仅在原始成年IBD患者队列中发现。相反，CD8+T细胞基因表达与年龄和性别之间的关联在所有3个队列中都被检测到。CD8+基因的转录与IBD相关。并且，克罗恩病患儿CD8+T细胞的DNA甲基化谱与年龄相关，但与疾病结局无关。该研究揭示了为IBD患者开发预后生物标志物的挑战，以及在临床应用前在大型独立队列中验证这些生物标志物的重要性。
论文ID
原名：Transcription and DNA Methylation Patterns of Blood-Derived CD8+T Cells Are Associated With Age and Inflammatory Bowel Disease But Do Not Predict Prognosis
译名：血液CD8+T细胞的转录谱及DNA甲基化谱与IBD预后无关
期刊：Gastroenterology
IF：17.373
发表时间：2021年1月
通讯作者：Matthias Zilbauer
通讯作者单位：英国剑桥大学阿登布鲁克医院儿科
DOI号：10.1053/j.gastro.2020.08.017
实验设计
2013年3月至2016年3月期间，研究者一共招募131名4至17岁(中位年龄为13岁)的儿童。炎症性肠病的诊断是根据当前的国际指南进行的，包括血清和粪便炎症标志物的测量、上消化道和下消化道内窥镜检查以及放射学和组织学检查。除IBD外，任何患有胃肠和/或肠外疾病的患者均被排除在研究之外。总共有71名患者被诊断为CD，41名患者被诊断为UC，19名患者被归类为非IBD健康对照。后者被定义为接受内窥镜检查作为其常规临床护理的一部分的患者，并且被发现其肠粘膜具有正常的宏观和组织学外观，并且任何胃肠症状完全消失。所有患者都接受了至少18个月的随访，并详细记录。在进行诊断性内窥镜检查的同一天，采集用于纯化CD8+T细胞的外周血样(体积根据年龄从10毫升到25毫升不等)。立即处理所有样品，并使用磁珠分选法分离CD8+T细胞，同时提取DNA和RNA。进行全基因转录组分析和DNA甲基化分析。详见图1。
结果
1 CD8+T细胞基因转录的变异与疾病、年龄、全身炎症和性别有关
CD8+T细胞的转录可塑性发生在全身炎症期间，据报道，在诊断为慢性炎症(包括炎症性肠病)的患者中存在明显的差异。研究者为了确定样本队列中CD8+T细胞基因转录的变异程度，研究者首先进行了主成分分析(PC)并测试了诊断时观察到的变异和表型之间的相关性。研究者发现CD8+T细胞基因转录的变异与诊断和年龄显著相关（图2A）。虽然观察到IBD样本和对照患者衍生样本之间存在重大重叠，对照样品中有89％（即19个样品中的17个）紧密聚集在一起，但一部分IBD样品在PC1中分离（图2B）。接下来，研究者对以前发表的从成年患者队列中获得的CD8+T细胞转录组进行了类似的分析，包括IBD患者和健康对照。如图2C和D所示，该成年患者队列中CD8+T细胞特异性基因转录的变异也与诊断、年龄和性别相关。与儿童样本类似，大多数成人对照样本紧密聚集在一起(78%的对照样本)，分离出一部分IBD患者衍生的CD8+T细胞转录组（图2D）。
图2.从新诊断为CD（n = 67），UC（n = 40）和健康对照（n = 19）的儿童以及以前发表的成年患者（CD n = 19，UC n = 19，非IBD对照n = 14，成人队列1）中获得的CD8+T细胞的全基因组转录谱队列。（A）在前10个病例中观察到儿童CD8+T细胞转录组的差异（上图）。热图显示诊断时观察到的转录变异与表型之间的相关性，以及选定的血清标志物（下图）。（B）儿童CD8+T细胞转录组的PC分析图，显示了来自非IBD对照的样品的紧密聚集（红色圆圈包含19个对照样品中的17个）。（C）成人CD8+T细胞转录组的差异也显示与诊断，性别和年龄相关。（D）成年CD8+T细胞转录组的PC分析图显示了相似的分布，并且大多数非IBD样品都紧密聚集（红色圆圈包含14个对照样品中的11个）。
2 在成人和儿童炎症性肠病患者队列中检测先前报道的预后性CD8+T细胞特异性表达信号的存在
CD8+T细胞特异性基因转录信号已被证明与患有多种免疫介导疾病的成人患者的疾病结局相关，包括抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎、系统性红斑狼疮以及诊断为CD和UC的成人患者。研究者分析了2个先前发表的成人(成人队列1和2)和儿童IBD患者样本队列中是否存在先前报告的CD8+T细胞特异性预后转录信号。使用相同的分析方法，研究者证实在首次在成人中发现的CD8+T细胞表达信号在成人CD和UC患者队列中存在。如图3A所示，根据特征基因的表达，无监督聚类分析将CD和UC患者来源的CD8+T细胞样本分为2个不同的组，根据治疗升级的次数，这些组的疾病结局不同（IBD1¼严重；IBD2¼轻微）。接下来，研究者将相同的表达信号应用于儿童数据集，选择成人IBD核心特征的基因，并将得到的表达谱进行无监督聚类。如图3B所示，在诊断时获得的儿童IBD样本（治疗初期，活动性疾病，n¼107）中，没有发现任何显著的聚集。考虑到青少年（12-16岁）和成人发病的IBD在疾病表型、行为和发病机制上的主要相似性，研究者进行了额外的分析，以检测先前报道的年龄较大的儿童（即12-16岁诊断的儿童）预后转录信号的存在。如图3C所示，忽略年轻的IBD患者后得到了类似的结果，没有观察到明显的聚类。接下来，研究者将第二个成人IBD患者队列（成人队列1）纳入分析，并应用先前报道的表达信号。与儿童来源的CD8+T细胞转录组类似，在38名成人IBD患者中，未观察到基于基因表达的明确聚类（图3D）。
综合上述研究，研究者认为无法证实先前报道的儿童或第二个成人IBD队列中存在预后CD8+T细胞衍生的转录信号。
图3.成人和儿童CD8+T细胞样品中疾病预后的转录信号。从全基因转录组中选择形成先前报道的基因转录信号，并进行分级聚类。（A）从诊断为CD的成年患者（n = 35，成年队列2）获得的CD8+T细胞中形成IBD预后表达的基因的热图和层次聚类。（B）所有新诊断为IBD的儿童（n = 107）预后表达的基因的热图和层次聚类。（C）被诊断为IBD的12至16岁的儿童（n = 74）预后表达的基因的热图和层次聚类。（D）成人队列1（n = 38）中预后表达的基因的热图和层次聚类。
3 儿童炎症性肠病中CD8+T细胞转录与疾病结局缺乏相关性
研究者通过将表达数据与临床结果相关联，测试整个儿童数据集是否存在潜在的儿童特异性预后特征。通过进行WGCNA，将WGCNA应用于成人CD患者表达数据（成人队列2）显示出数个强大的基因表达模块，其中一些与报告的患者结局状态显著相关（即IBD1/IBD2，图4Ai）。观察到形成这些模块的基因与先前报道的预后表达信号重叠（图4Aii）。此外，发现定义top模块的基因表达可根据结果状态对患者进行聚类，从而证实了该分析方法的有效性（图4Aiii）。与成人CD数据集获得的结果相反，儿童CD数据集分析得到的基因模块与任何临床结果参数（包括治疗升级次数、生物制剂治疗要求、手术或疾病结果总分）均无显著相关性，旨在说明疾病结果不是由单一测量确定的事实（图4Bi）。研究者通过识别性别和年龄的模块-特质关系证实该方法在儿童样本队列中的有效性，尽管后者仅在UC患者来源的样本中达到统计学意义（图4Bii）。
综合上述研究结果，研究者认为在新诊断为IBD的儿童中，CD8+T细胞转录与疾病结局参数之间缺乏相关性。
图4. 成人发病（成人组2）（A）和儿童发病（B）CD中CD8+T细胞转录组的WGCNA。（Ai）模块-特质关系热图显示基因模块及其与年龄、性别和结果等级（重度与轻度）的相关性。数字表示模块和特征之间的相关程度（顶部）和校正的P值，评估关联的统计显著性（括号中）。（Aii）来自图2A（灰色）和顶部相关模块（蓝色和绿松石色）的形成成人IBD预后表达特征的基因之间的重叠。（Aiii）形成蓝色模块的基因的层次聚类和热图。（Bi）新诊断为CD的儿童CD8+T细胞的前10个模块-性状关系热图。（Bii）基于形成与性别相关的基因模块（暗红色模块）的基因的层次聚类和热图。
4 儿童患者样本中与CD8+T细胞衰竭相关的基因表达显示出有限的变异
据报道，T细胞衰竭是导致成人IBD发病差异的潜在机制行为。研究者根据与T细胞衰竭相关的基因进行无监督聚类分析。虽然衰竭相关基因的表达将原始成人CD患者队列衍生的转录组分为不同的亚组（成人队列2，图5A），但没有观察到儿童的CD8+T细胞转录组中有任何显著聚集（n¼188，图5B）。因此研究者认为，IBD患者来源的CD8+T细胞中的T细胞衰竭相关基因转录变化不足以检测现有队列中患者样本的可重复聚类。
图5. CD8+T细胞中与T细胞衰竭相关基因的转录变异。
5 CD8+T细胞DNA甲基化与年龄相关，但与新诊断克罗恩病患儿的疾病转归无关
DNA甲基化已被证明可调节CD8+T细胞的功能，包括细胞分化和衰竭。此外，表观遗传学介导的T细胞功能的改变已牵涉到几种免疫介导的疾病的发病机理。研究者对新诊断为CD的儿童（n=66）的CD8+T细胞进行了全基因组DNA甲基化分析。这些样本中观察到的变异显示出与疾病分布，性别，年龄和炎性标志物显着相关（图6A）。与CD8+T细胞转录组类似，DNA甲基化与临床结果之间没有任何显着相关性（图6 B）。同时研究者应用“表观遗传时钟”算法证实了基于DNA甲基化的预测年龄与时间年龄之间的显著相关性（图6C）。同时研究者还观察到，在两个成人数据集中，naïve CD8+T 细胞的比例与年龄呈显著的负相关，以及记忆CD8+T细胞比例呈年龄依赖性增加（图6D）。
研究者的结果进一步强调年龄是影响CD8+T细胞功能的可能因素，并解释了患者队列之间的明显差异的原因。
图6. 来自CD8+T细胞的全基因组DNA甲基化谱。（A） 从新诊断为CD的儿童（n=66）获得的CD8+T细胞DNA甲基化中观察到的变异。（B） 儿童CD患者来源的CD8+T细胞DNA甲基化的PC分析图。（C） 表观遗传时钟应用于新诊断为CD的儿童的CD8+T细胞DNA甲基化分析（D）基于DNA甲基化谱的CD8+T细胞的比例。
讨论
在IBD患者中，通过预测个体患者的临床结果，找到准确的疾病预后生物标志物仍然是有效个性化治疗的基本要求。目前有研究发现，CD8+T细胞功能的差异与慢性炎症无关，T细胞衰竭可能是导致这一现象的原因。衰竭的CD8+T细胞表达表型的个体参与了免疫介导的病程，同时更容易感染传染病。在本文中，作者调查了一个大型前瞻性招募的新诊断为IBD的儿童队列中CD8+T细胞的转录情况，并将数据集与2个先前发表的成人IBD队列进行了比较。发现，尽管能够在原始患者队列（成人队列2）中复制先前报道的CD8+T细胞转录特征，但无法在儿童或第二个成人IBD患者队列（成人队列1）衍生的全基因组图谱中复制这些结果。此外，在儿童患者队列中，无法发现CD8+T细胞基因转录或DNA甲基化与临床结果之间的任何相关性。作者强调了在独立队列中验证的重要性。在所有年龄段的IBD患者中建立一个有效的临床结果评分对于现有和未来的生物标志物的验证是至关重要的。与疾病结果相反，作者发现CD8+T细胞基因转录与所有3个样本组的性别和年龄之间存在显著的和可重复的相关性。虽然前者不太可能与IBD发病机制有重大关系，但与年龄相关的T 细胞功能变化可能会导致儿童和成人IBD的表型差异，表明人类衰老对人类的免疫能力影响很大。本研究的一个局限性是，由于数组类型的不同，以及缺乏匹配的、公开的临床元数据，无法合并成人和儿童数据集。
结论
1 科研│GASTROENTEROLOGY：肠道炎症调节ACE2和TMPRSS2表达并可能与SARS-CoV-2相关疾病发病机制重叠
不来关注一波嘛
END
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