编译：微科盟澜粒粒，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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萌发是成熟种子的胚根开始穿透周围的屏障发育成幼苗的一个过程，已有多种环境因素对其过程产生影响。对于高盐度如何影响C4植物（玉米）种子的发芽知之甚少。本文研究了胚，胚乳，完整的种子在不同盐浓度处理的萌发状况。推测玉米胚乳可能参与感知盐信号并将其转导到周围组织中。由于盐响应涉及植物激素脱落酸（ABA），作者分析了ABA的分布和数量，发现NaCl处理下离体胚ABA水平没有比水处理高，表明ABA水平的升高是一个胚乳依赖的过程。作者综合转录组和蛋白质组学技术，分析发现盐处理的胚胎和胚乳之间转录和翻译变化存在显著差异，表明选择性剪接可能介导了玉米种子萌发过程中对盐胁迫的早期响应。
论文ID
原名：Comprehensive transcriptome and proteome analyses reveal a novel sodium chloride responsive gene network in maize seed tissues during germination
译名：综合转录组和蛋白质组分析揭示玉米种子萌发过程中氯化钠响应基因网络
期刊：Plant Cell and Environment
IF：6.362
发表时间：2020年7月
通讯作者：刘鹰高
通讯作者单位：山东农业大学
DOI号：10.1111/pce.13849
实验设计
结果
1 实验条件与生理测定
实验对玉米（B73）种子进行了递增浓度的氯化钠的处理。在50 mM NaCl处理组观察到，盐对种子发芽具有显着的抑制作用。在200 mM NaCl处理组中，玉米种子的发芽率大大降低。因此，将200 mM的NaCl用作随后的转录组和蛋白质组实验的应激条件。为了研究种子萌发期间对盐胁迫的早期组织特异性响应，选择了一个时间点（NaCl处理后6小时）和两个组织（胚乳和胚）。有趣的是，几乎所有分离的胚（E组）在200 mM NaCl处理下都能发芽，而在如此高的盐浓度下，整粒种子（W组）和半胚乳种子的发芽受到抑制（图1）。此外，脱落酸（ABA）抑制所有三个测试组的发芽，而赤霉素（GA）在对照条件下对玉米发芽的作用较小，并略微缓解了NaCl处理的抑制作用。结果还表明，与完整种子相比，胚乳一半的种子中NaCl对种子发芽的抑制作用较弱（图1a，b）。这些结果表明玉米胚能够转导ABA信号以维持未发芽状态，但是该组织在发芽过程中无法感知NaCl信号。此外，种子组织与下游调节网络之间的盐信号尚待阐明。为了研究上述研究问题，作者应用了全基因组学分析技术。与以前的研究类似，内部生物信息学分析流程用于转录本变化，转录后事件（PTE）和差异表达蛋白（DEP）的综合分析。此外，在以下结果中总结了参与ABA和GA信号通路的基因以及上游调节成分，例如剪接因子和转录因子。
图1. 在不同胁迫和激素处理下不同部位玉米种子的发芽率。（a）在不同处理下3天种子不同部分的发芽表型。不同的处理浓度：200 mM NaCl，100μM ABA，200 mM NaCl +10μM GA，10μM GA。（b）接受3天各种处理（如A中所述）的完整种子，半胚乳种子和仅胚芽的发芽百分比。E，仅胚胎；H，种子无半胚乳；W，整个种子。不同字母（a-f）代表治疗组比较之间的显着差异（p <0.05，基于单因素方差分析）。
2 大多数玉米基因在种子萌发过程中发生转录后修饰以响应高盐度
通过srRNA-seq分析以阐明NaCl处理期间胚乳和胚胎组织中转录和转录后的变化。有趣的是，与水对照组相比，在处理后6小时差异表达的基因相对较少（图2a）。在盐处理过的胚胎和胚乳中分别仅观察到57和148个差异表达基因（DEG）（图2a和表S2））。相反，记录了主要的转录后事件，表明转录后调控（如选择性剪接）可能是玉米早期盐胁迫响应中更为主要的调控机制。与水对照组相比，在盐处理过的玉米胚和胚乳中分别检测到来自4,529个基因的14,570个差异表达的转录后事件（DPTE）和来自4,756个基因的15,023个DPTE（图2a和表S3）。通常，每个样本中大约鉴定出40,000个转录后事件（PTE）（图2b和S2））。特别是，替代性聚腺苷酸化（APA）占总PTE的50％，而另一种PTE，替代性转录起始（ATS）是在所有12个样品中检测到的第二丰富的PTE（图2b）。随后的KEGG富集分析表明，两种组织可能以不同的KEGG途径富集（图2c）。例如，胚乳中富含参与亚油酸代谢的DEG和参与核糖体生物发生的DPTE，而胚中富含属于核糖体和蛋白酶体KEGG途径的DPTE。尽管相同的KEGG通路（例如剪接体，RNA转运和mRNA监测途径）在胚胎和胚乳数据集中都得到了丰富，但观察到这些途径中的独特基因与特定的组织类型相关（图2d）。通过对每个剪接亚型的实时定量PCR (qRT-PCR)验证了具有代表性的DPTE，表明亚基因水平发生了实质性变化（图2E和S3））。这些结果表明，在早期盐反应期间，玉米胚和胚乳对高盐分胁迫的反应可能不同。此外，转录后的变化（例如APA和ATS的引入以及选择性剪接）可能是盐处理下的主要调控机制。
图2.高盐度玉米萌发过程中差异表达基因（DEG）与差异表达转录后事件（DPTE）的比较。（a）处理组的DEG和DAS事件之间比较的数据集的维恩图：水对照组（CE或CR）和200 mM NaCl（SE或SR）处理的胚胎（E）和胚乳（R）组织。（b）在所有样本中确定和分类DPTE。AE3'，替代受体；AE5'，替代供体；AFE，替代性第一外显子；ALE，替代的最后一个外显子；APA，可替代的聚腺苷酸化；ATS，替代转录开始；IR，内含子保留；MIR，多个内含子保留；MSKIP，跳过多个外显子；SKIP，外显子跳过。（c）胚胎和胚乳组织中DEG和DPTE的KEGG通路富集分析。“加粗”为在胚胎和胚乳的数据集中反复发现的途径。（d）维恩图代表胚胎和胚乳数据集之间KEGG剪接体的独特且共享的位点。（e）DAS基因的验证。Phytozome的主要转录本模型标记为星号。左侧面板中标记了每个转录异构体（AS1，AS2和AS3）的百分比，而右侧面板中通过qRT-PCR检测了整个基因和每种异构体的表达水平。“ **”表示该值明显高于或低于其对照组（例如，SR对CR或SE对CE）（e）DAS基因的代表性验证。Phytozome的主要转录本模型标记为星号。左侧面板中标记了每个转录异构体（AS1，AS2和AS3）的百分比，而右侧面板中通过qRT-PCR检测了整个基因和每种异构体的表达水平。“ **”表示该值明显高于或低于其对照组（例如，SR对CR或SE对CE）。
3 高盐度下的蛋白质组学的变化
为了进一步表征在盐胁迫下的蛋白质组变化，对与转录组分析相同的样品进行了基于SWATH-MS的蛋白质组学定量分析。在这种情况下，总共从159,195个高质量MS质谱图中鉴定出2767种蛋白质（1％FDR）。其中2429种通过先前使用的无标记定量方法进行定量，表明在这项研究中可以捕获更多的蛋白质。与水对照相比，盐处理的胚胎中总共发现了243和419种蛋白质被上调和下调（图3a和表S4）。此外，与水对照相比，盐处理过的玉米胚乳中分别观察到389和234蛋白被诱导或减少（图3a和表S5）。GO富集分析表明，尽管不同的处理组有共同的GO富集通路，但在上胚乳的上调蛋白质中，GO trem如线粒体包膜，内质网和蛋白酶体核心复合物被富集（图参见图3b和表S6），表明基因在这些GO trem中的独特参与涉及对玉米胚乳的高盐度响应的独特功能。此外，观察到DEG和DEP数据集之间的微小重叠，这意味着此处确定的大多数DEP可能不是从头基因表达的直接翻译产物。选择的DEPs在转录水平上对其不同的亚型进行了表达验证(图3C)，揭示了其在亚型水平上的复杂调控。
图3. 盐发芽过程中玉米胚与胚乳组织之间差异表达蛋白（DEP）数据集的比较。（a）四种处理蛋白的维恩图。（b）蛋白质组学中四种处理之间的GO富集分析。（c）DEP基因及其剪接同工型的qRT-PCR验证。Phytozome的主要转录本模型标记为星号。标记了每个转录本同工型（例如AS1，AS2或AS3等）的百分比，同时还显示了整个基因和每个同工型的表达水平。“ **”表示通过学生t检验，该值明显高于或低于对照组（例如SR vs. CR或SE vs. CE）（p <0.05）。
4 NaCl处理下ABA和GA相关基因的综合分析
植物激素，ABA和GA是介导盐胁迫响应的主要内部信号。因此，在RNA-Seq和SWATH-MS蛋白质组数据集中筛选了与这两种激素的代谢，信号传导和下游靶基因有关的基因（图4，表S7和S8）。鉴定了2个DEG，2个DEP和96个DPTE与ABA相关，而2个DEP和12个DPTE与GA相关（表S8），表明这些激素基因在盐处理后转录后发生明显变化。
图4. 玉米萌发在盐处理过程中激素相关基因的鉴定和比较。（a）Venn图代表五个处理组之间独特且共享的基因。五个处理中玉米ABA（b，c）和GA相关（d）基因的综合比较。
5 免疫荧光法显示玉米胚乳在盐处理下仅能感觉到ABA
由于大量表达变化被观察到关于差异表达的基因和ABA和GA相关基因的蛋白质（图4），因此使用ABA免疫荧光，液相色谱-质谱（LC-MS）进行了独立的实验，验证ABA的量，ABA和GA相关基因的基因表达定量。ABA在不同玉米种子组织中的免疫荧光表明，与完整种子中相邻的胚乳相比，胚胎的ABA水平更高。此外，盐处理增强了ABA的积累，特别是在完整种子和没有半胚乳的种子的胚组织中（图5a，b）。但是，单独使用离体胚胎时，盐处理根本不诱导ABA水平（图5a，b）。LC-MS对ABA定量的结果相似（图5c）。此外，对不同的组织样品的ABA和GA相关基因进行qRT-PCR分析，结果表明参与ABA生物合成的基因不受影响，而ABA代谢基因在盐胁迫下被下调（图6a，b）。一种ABA响应基因ABI4从全种子（1-4组）和没有半胚乳的种子（5-8组）中，在胚芽和胚乳中都发现了，在盐胁迫下被诱导。相反，当使用分离的胚胎（第9组和第10组）进行盐处理时，未发现该基因的诱导（图6c）。另一个ABA响应基因ABI5在所有处理组之间均没有显著性差异（图6d）。此外，一个GA生物合成基因（KS1）在盐处理下也受到调节（图6e，f）。
图5. NaCl促进ABA在胚胎中的积累。（a）种子的横断面和纵断面中的ABA免疫荧光。E‐T，种子的横截面，仅剩下胚；H-E-T，种子胚的横截面，没有半胚乳；H‐T，种子的横截面，无半胚乳；W-E-T，整个种子胚的横截面；W‐L，整个种子的纵截面；W‐T，整个种子的横截面。NaCl浓度为200 mM。（b）图A中荧光部分的总荧光强度的倍数变化。*表示与0 mM相比有显着差异（P <0.05，基于t检验）。（c）200 mM NaCl处理后检测玉米种子中的ABA含量。W-EM，整个种子的胚；W-EN，整个种子的胚乳；H‐EN，种子胚乳，无一半胚乳；H–E，无半胚乳的种子胚；E，种子胚无胚乳。*表示与0 mM相比有显着差异（ 基于t检验，P <0.05）。
图6. NaCl处理下ABA生物合成，信号和代谢基因以及GA生物合成基因的表达。（a–c）在200 mM NaCl或处理下ABA生物合成基因，ABA代谢基因和ABA信号转导基因的表达水平。（e）和（f）在200 mM NaCl处理下，GA生物合成基因的表达水平。1–10的数字表示在水分控制或NaCl处理下种子的不同部分。（1）水处理种子的胚；（2）200 mM NaCl处理的种子的胚；（3）水处理种子的胚乳；（4）200mM NaCl处理种子的胚乳；（5）将未经半胚乳的种子胚用水处理；（6）200mM NaCl处理无胚乳种子的胚。（7）种子胚乳，半胚乳不加水；（8）200mM NaCl处理没有半胚乳的种子的胚乳；（9），单胚用水处理；（10）200 mM NaCl处理的单个胚。
6 剪接因子和转录因子均被调节为DPTE
鉴于转录调节转录因子和替代性剪接调节剪接因子在不同处理组中蛋白含量至关重要，因此从组学数据中总结了转录因子（TF）和剪接因子（SF）的信息（图7）。在两个组织DPTE数据集中发现了来自30个亚组的200多个剪接因子和来自48个家族的200多个转录因子（图7），这表明SF和TF均响应高盐度而经历大量的转录后调控。有趣的是，发现了超过20个剪接因子作为DEP（图7a），而在胚胎DEP列表中仅识别出两个转录因子（图7b），这表明早期盐响应的功能调节可能会明显地集中于剪接及其调节因子SFs。此外，发现NaCl在胚乳和胚胎中都降低了一些与乙烯相关的TFs。
图7.玉米种子萌发过程中参与高盐响应的剪接因子和转录因子的概述。盐胁迫发芽过程中鉴定的玉米剪接因子（a）和转录因子（b）的韦恩图。从DPTE中鉴定的剪接因子（c）和转录因子（d）的亚组分类。
讨论
非生物胁迫（例如干旱，低温或高温和高盐度）严重影响植物生长的各个方面。这些方面之一是幼苗发芽。萌发是重要的农艺性状，也是植物启动其生长的关键事件。因此，破译玉米种子对盐胁迫的调节机制对于理解植物对盐田条件的响应具有重要意义，在这些不利条件下，可以利用盐胁迫条件诱导作物建立幼苗的耐盐作物发芽机制。在这项研究中，研究者表明对发芽种子施加的盐分胁迫能够诱导胚胎，胚乳转录组和蛋白质组发生剧烈变化。在盐处理下的早期响应期间（盐处理后6小时），转录后和翻译后的法规可能比转录更重要。此外，生理和免疫荧光实验表明，胚乳可能响应盐信号和向其周围组织中传递信息。但是，盐诱导胚中的ABA水平高于胚乳，这与双子叶植物拟南芥中的ABA完全不同。但是，该过程的潜在机制仍有待进一步阐明。盐诱导胚中的ABA水平高于胚乳，这与双子叶植物拟南芥中的ABA完全不同。但是，该过程的潜在机制仍有待进一步阐明。
在这项研究中，ABA被认为是一种可以对高盐浓度做出反应的主要激素。盐会增加胚乳和胚中的ABA水平（图5）。但是，当从种子中除去胚乳时，高盐度不会诱导胚胎ABA含量（图5）。这表明在高盐度下，胚乳在种子萌发过程中对传感和向胚胎组织传递信号至关重要。此外，在盐处理下，与ABA生物合成，代谢和信号传导途径有关的基因在剪接模式和蛋白质丰度方面均发生了实质性变化，这表明整个ABA途径都受到盐处理的积极调节，尤其是在转录后和蛋白质水平（图4）。
另外，转录后和翻译在玉米种子萌发过程中对早期盐反应性起关键作用。在这项研究中，作者综合了转录组学和蛋白质组学方法，以便系统地揭示出萌发初期对盐处理的响应的多层调节网络。数据表明，成千上万的基因产生转录亚型，数百种蛋白质响应盐处理而差异表达。考虑到干种子包含大量存储的前mRNA，研究者假设转录后和翻译调控对盐胁迫的响应速度比转录调控快。KEGG途径（如RNA转运，剪接体和RNA监测）在转录后调控中被富集（图2c），表明响应高盐度会激活剪接机制和RNA监测。此外，超过20个与剪接相关的蛋白在胚胎和胚乳之间的蛋白水平差异表达。蛋白质在胚芽和胚乳之间表现出相反的表达方式，这意味着这些蛋白质可能是上游调节剂，说明盐胁迫下玉米胚芽和胚乳之间存在差异生理反应。此外，一些转录因子在蛋白质水平上表现出差异表达，表明它们在响应长期盐胁迫中激活或抑制下游目标的潜在作用。有趣的是，两个TFs如GRMZM2G055180（乙烯响应转录因子2）和GRMZM2G040481（乙烯不敏感3-like 5蛋白）被鉴定为乙烯响应转录因子，表明乙烯参与了玉米盐萌发过程。
此外，外部盐信号将引发玉米胚乳的大量转录后和翻译后变化（图8）。在翻译水平上，差异积累的SF可能会导致各种类型的TF之间剪接异构体的实质性变化。这些活化的TF反过来会活化ABA或GA相关途径中的下游基因。盐处理过的玉米胚中也有类似情况。额外的响应信号可能会通过未知成分转导至胚胎，从而在另一批基因和蛋白质上的转录后和翻译水平上引起实质性变化。随后，胚和胚乳组织中的ABA水平升高，以维持玉米种子的未发芽状态。
图8. 玉米盐萌发途径的转录后和翻译调控模型。在玉米胚乳和胚胎组织中观察到的氯化钠响应机制的简要模型。ABA，脱落酸；NaCl，氯化钠；SF，剪接因子；TF，转录因子。
结论
本研究提出了玉米种子中盐分感应和信号转导的新模型。综合转录组和蛋白质组学揭示了种子萌发在三个调控层的空间动态，包括转录，转录后和翻译。首先，剪接因子和转录因子的蛋白质丰度变化对响应早期盐胁迫至关重要。其次，转录后的变化（如选择性剪接）被认为是对盐胁迫的主要响应机制。第三，与ABA和GA相关的基因被融合为调节激素稳态和维持玉米种子未发芽状态的主要目标。本研究为单子叶植物对盐胁迫的早期反应提供了新的见解。
1 科研│PLANT PHYSIOL（IF：6.902）：互叶梅雄性配子体功能的转录和蛋白质组学研究
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