编译：微科盟 橙子，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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转移是癌症患者治疗失败的主要因素，但其机制尚待阐明，迫切需要新的有效治疗策略。本研究旨在探索食管鳞状细胞癌（ESCC）中新的关键转移相关microRNA（miRNAs）。研究者比较高转移性食管鳞癌细胞亚系的miRNA表达谱，通过体内与亲本细胞的连续筛选，发现miR-515-3p在食管鳞癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织，也在转移性食管鳞癌组织中进一步降低，且与晚期、转移及患者生存显著相关。体内外实验结果表明，miR-515-3p可以增加上皮细胞标志物的表达，降低间充质细胞标志物的表达，更重要的是抑制ESCC细胞的侵袭和转移。在机制上，研究者发现miR-515-3p分别通过结合编码序列和3个非翻译区直接调控vimentin和基质金属蛋白酶-3（MMP3）的表达。此外，全基因组甲基化测序和甲基化特异性PCR结果表明，miR-515-3p启动子内的CpG岛在ESCC细胞系和ESCC肿瘤组织中明显高甲基化，这可能导致miR-515-3p在ESCC中的表达失调。此外，临床前实验也证实了miR-515-3p寡核苷酸对裸鼠ESCC细胞的转移有明显的抑制作用。综上所述，这项研究表明miR-515-3p抑制肿瘤转移，因此在食管鳞癌中是一个有前途的预后生物标志物和治疗策略。
论文ID
原名：Identification of miR-515-3p and its targets, vimentin and MMP3, as a key regulatory mechanism in esophageal cancer metastasis: functional and clinical significance
译名：miR-515-3p及其靶点vimentin和MMP3在食管癌转移中的功能和临床意义
期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
IF：13.493
发表时间：2020年11月
通讯作者：李斌 & 何庆瑜
通讯作者单位：暨南大学
DOI号：10.1038/s41392-020-00275-8
实验设计
结果
1 miR-515-3p调控与食管癌患者生存相关
为了筛选和鉴定哪些miRNAs调控癌症转移，研究者比较了通过连续体内选择获得的高转移性ESCC亚系KYSE150-Luc-LM3（补充图S1a）和KYSE150-Luc亲本细胞的miRNAs谱（图1a，b）。一些众所周知的转移抑制miRNAs，如miR-124和miR-708，在高转移性ESCC亚系中的表达水平显著降低，强烈表明该模型可用于分析转移相关的miRNAs。在KYSE150-Luc-LM3细胞中前50个下调的miRNAs中，在一项初步研究中选择了6个miRNAs，以检测它们对癌细胞侵袭的影响，这些miRNAs以前没有报道过参与肿瘤转移。本研究结果显示miR-515-3p过表达明显抑制KYSE150-Luc-LM3细胞的侵袭潜能（补充图S2a，b），成为本研究的重点。与正常永生化食管上皮细胞相比，食管鳞癌细胞中miR-515-3p的表达较低（图1c）。研究者还通过系列体外筛选建立了高侵袭性亚系KYSE410-Luc-I6（补充图S1b），并发现在高侵袭性和转移性亚系KYSE410-Luc-I6和KYSE150-Luc-LM3中miR-515-3p表达进一步降低（图1d）。
为了评估miR-515-3p在食管鳞癌中的临床意义，研究者通过原位杂交分析含有100例原发性食管鳞癌组织和70例邻近正常组织的微阵列中的miR-515-3p表达情况（图1e）。大多数肿瘤组织的miR-515-3p染色弱于相应的正常组织（图1f）。如图1g所示，45.7%（32/100）的正常组织显示miR-515-3p高表达，而只有22.0%（22/100）的肿瘤组织显示miR-515-3p高表达。低miR-515-3p表达与癌症患者的晚期和淋巴结转移显著相关（表1）。更重要的是，低表达miR-515-3p的患者的生存期（中位生存期=22.4个月）明显短于高表达miR-515-3p的患者（中位生存期=57.0个月）（图1h）。
另外，用46例正常组织、原发性肿瘤（T1&2、T3&4）和转移性肿瘤的ESCC的TMA分析miR-515-3p表达与转移的关系。如图1i，j所示，大多数正常组织中miR-515-3p的表达高于原发性肿瘤（T1&2，T3&4）和转移性肿瘤，miR-515-3p的表达与肿瘤分期和转移有关。来自OncomiR癌症数据库的数据分析表明，miR-515-3p的表达与食管癌患者的生存率显著相关（补充图S2c）。此外，miR-515-3p的表达也与其他几种癌症类型（如肾乳头状细胞癌）的临床参数和生存率相关（补充表1和表2）。这些数据表明miR-515-3p可能是一种新的肿瘤诊断和预后的生物标志物。
图1. miR-515-3p在食管鳞癌中作为潜在肿瘤转移调节因子的鉴定及其临床意义。a在KYSE150-Luc-LM3和亲本细胞中发现差异表达的miRNA的实验图。b KYSE150-Luc-LM3和KYSE150-Luc细胞miRNA图谱的热图。红色表示高丰度，蓝色表示低丰度。c qRT-PCR法比较miR-515-3p在食管鳞癌细胞和永生化正常食管上皮细胞中的表达。d通过qRT-PCR比较miR-515-3p在建立的KYSE150-Luc-LM3和KYSE410-Luc-I6细胞以及亲本细胞中的表达。e食管鳞癌中miR-515-3p不同染色评分的代表性结果。f原位杂交检测miR-515-3p在配对ESCC组织和正常组织中表达水平的代表性结果。g 100例ESCC原发肿瘤组织和70例癌旁正常组织miR-515-3p表达的比较。h根据miR-515-3p的表达，采用Kaplan-Meier图分析100例ESCC患者的总生存率。i应用原位杂交技术检测46例正常组织、原发性肿瘤（T1&2、T3&4）和转移性肿瘤中miR-515-3p的表达。
表1. 100例食管癌中miR-515-3p表达水平与临床病理参数的相关性。
2 在ESCC细胞系和组织中miR-515-3p被启动子高甲基化沉默
为了研究miR-515-3p在食管鳞癌中的表达下调是否由于启动子甲基化引起的，研究者用表观遗传修饰剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza）处理食管鳞癌细胞，并与对照细胞进行比较。研究者发现5-Aza处理以剂量依赖的方式显著增加miR-515-3p的表达（图2a）。全基因组甲基化测序确定了2个ESCC细胞系和1个永生化正常食管上皮细胞系中的DNA甲基化状态，并且在miR-515-3p的启动子区域中观察到5 CpG岛的重甲基化（图2b）。值得注意的是，甲基化特异性PCR的结果显示，在所检测的ESCC细胞系中，miR-515-3p内的CpG岛显著地高度甲基化，但在永生化的正常食管上皮细胞中没有（图2c）。如图2d所示，比较了食管鳞癌细胞系的侵袭能力，结果显示miR-515-3p甲基化水平与食管鳞癌细胞系的侵袭能力显著正相关（r=0.82，p<0.05）。研究者还测定了28对ESCC肿瘤和正常组织中miR-515-3p的甲基化水平和表达水平（图2e，f）。与配对正常组织相比，60.7%（17/28）的食管鳞癌组织中发现miR-515-3p显著高甲基化（图2e），64.3%（18/28）的食管鳞癌肿瘤组织中miRNA-515-3p的表达低于邻近正常组织（图2f）。研究者发现在28对ESCC组织和正常组织中，miR-515-3p的表达与其甲基化水平呈负相关（r=0.46，p<0.05）（图2g）。这些数据暗示启动子甲基化导致食管鳞癌中miR-515-3p表达的解除调控。
3 miR-515-3p抑制ESCC的侵袭和转移
miR-515-3p在ESCC侵袭转移中的作用尚未见报道。miR-515-3p过度表达的稳定细胞系在先前建立的高度侵袭性和转移性ESCC细胞KYSE410-Luc-I6和KYSE150-Luc-LM3中产生（图3a）。结果表明，与表达干扰miRNAs的相应亲本细胞系相比，KYSE410-Luc-I6-miR-515-3p和KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p细胞具有较低的侵袭、迁移和粘附能力（图3b和补充图S3a）。研究分析EMT标记物的表达，发现在miR-515-3p过度表达的ESCC细胞中观察到纤维连接蛋白和N-cadherin表达减少而E-cadherin和ZO-1表达增加（图3c）。另一方面，还成功构建了miR-515-3p敲除的ESCC细胞系，命名为KYSE150-Luc-ZIP-miR-515-3p和EC109-ZIP-miR-515-3p（图3d）。如图3e和补充图S3b所示，抑制miR-515-3p表达增加了ESCC细胞的侵袭、迁移和粘附能力。研究者还发现，与对照细胞相比，miR-515-3p敲低的ESCC细胞中Ecadherin和ZO-1的表达减少，纤维连接蛋白和N-cadherin的表达增加（图3f）。此外，结果显示，miR-515-3p在24小时内没有对ESCC细胞的增殖和凋亡产生任何变化（补充图S4a，b），消除了miR-515-3p过表达细胞侵袭能力较弱是由于其对增殖和凋亡的影响的可能性。
此外，在实验性转移实验中，将KYSE150-luc-LM3-miR-515-3p细胞静脉注射到小鼠尾静脉，并用生物发光成像监测肺转移，结果显示miR-515-3p显著抑制肺转移，肺切片苏木精和伊红（H&E）染色证实了这一点（图3g）。相反，功能丧失实验显示miR-515-3p的敲除显著促进肺转移（图3h）。总之，这些结果首次表明miR-515-3p可能是一种新的癌细胞侵袭和转移抑制因子。
4 miR-515-3p直接靶向并抑制vimentin和MMP3的表达
为了探索miR-515-3p发挥其生物学功能的分子机制，通过RNA测序比较KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p和KYSE150-Luc-LM3-miR-CON细胞的基因谱（补充图S5a），发现KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p细胞中有173个转录本下调（倍数变化>1.5）（补充图S5b）。同时，使用miRNA靶点预测算法鉴定miR-515-3p的潜在靶点。在严格的标准下，文氏图显示两种方法中有5个基因被鉴定为miR-515-3p的潜在靶点（图4a）。在这5个重叠基因中，vimentin和MMP3被广泛认为是促进肿瘤侵袭和转移的关键调控因子，miR-515-3p可能通过调节vimentin和MMP3发挥抑制肿瘤迁移的作用。
统计分析表明miR-515-3p可能的直接结合位点分别位于vimentin的编码序列（CDS）和MMP3的3-UTR中（图4b）。为了验证，研究者使用3-UTR荧光素酶报告分析，发现转染KYSE150细胞中的miR-515-3p模拟物导致vimentin CDS和MMP3 3-UTR的相对荧光素酶活性明显降低，但当miR-515-3p模拟物与突变体MMP3 3-UTR或vimentin CDS共转染时，荧光素酶活性没有受到抑制（图4c）。在miR-515-3p稳定过表达的高侵袭性和转移性细胞系中，在mRNA和蛋白质水平观察到vimentin和MMP3表达的显著降低（图4d，e）。相反，随着miR-515-3p的稳定敲除，ESCC细胞中vimentin和MMP3的表达水平上调（图4f，g）。
此外，获得和丧失功能实验和western印迹分析表明，瞬时转染miR-515-3p模拟物或miR-515-3p表达质粒不仅在mRNA和蛋白质水平上显著降低vimentin和MMP3的表达，但也降低了ESCC细胞系中纤维连接蛋白和N-cadherin的表达（图4h和补充图S6a，b），而用抑制剂沉默miR-515-3p对vimentin、MMP3和EMT标记物有相反的影响（图4i和补充图S6c）。
这些数据表明miR-515-3p通过分别结合CDS和3-UTR区域影响vimentin和MMP3的表达水平，提示miR-515-3p的下调可能导致vimentin和MMP3介导的肿瘤侵袭和转移。
5 Vimentin和MMP3介导miR-515-3p对癌细胞迁移率的影响
接下来研究了vimentin和MMP3在miR-515-3p在肿瘤转移中的作用。研究者比较了I6和LM3细胞共同过表达miR-515-3p和vimentin，或miR-515-3p和MMP3，或miR-515-3p，或miR-515-3p，vimentin和MMP3 （ KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p-vimentin, KYSE150-Luc-LM3-miR- 515-3p-MMP3,KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p-vimentin+MMP3,KYSE410-Luc-I6-miR-515-3p-vimentin, KYSE410-Luc-I6-miR-515-3p MMP3, KYSE410-Luc-I6-miR-515-3p-vimentin+MMP3）或单独的miR-515-3p（KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p-CON, KYSE410-Luc-I6-miR- 515-3p-CON）和对照细胞（KYSE150-Luc-LM3-miR CONCON, KYSE410-Luc-I6-miR-CON-CON）的EMT标记物表达水平及其侵袭和迁移能力。在miR-515-3p过度表达的细胞中观察到纤维连接蛋白和N-cadherin表达降低以及E-cadherin和ZO-1表达增加，并且这些效应被单独的vimentin或MMP3或vimentin和MMP3的异位表达所消除（图5a）。室内实验结果表明，miR-515-3p对ESCC细胞的侵袭和迁移具有显著的抑制作用，而vimentin或MMP3的过度表达显著恢复了miR-515-3p过度表达的ESCC细胞的侵袭和迁移能力（图5b和补充图S7a）。相反，用shRNA进一步抑制敲低miR-515-3p的ESCC细胞系中vimentin和MMP3的表达（图5c）。如图5c、d和补充图S7b所示，vimentin或MMP3的敲除显著消除了miR-515-3p敲除对ESCC细胞侵袭、迁移和EMT标记物表达的影响。总之，本研究证明miR-515-3p通过直接靶向vimentin和MMP3抑制肿瘤的侵袭和转移。
6 miR-515-3p的全身给药抑制肿瘤转移
鉴于miR-515-3p在ESCC转移中具有重要作用，接下来评估miR-515-3p治疗转移性ESCC细胞的疗效。首先，作者研究了miR-515-3p寡核苷酸在ESCC细胞中的作用，转染miR-515-3p寡核苷酸的细胞比转染miR-CON寡核苷酸的细胞具有更低的侵袭、迁移和粘附能力（补充图S8a，b）。在转染miR-515-3p寡核苷酸的细胞中观察到纤维连接蛋白和N-cadherin表达减少以及E-cadherin和ZO-1表达增加（补充图S8c）。裸鼠尾静脉注射KYSE150-luc-LM3细胞建立实验性转移模型，2周后静脉注射含胆固醇修饰的miR-515-3p或miR-CON寡核苷酸（图6a）。采用生物发光成像监测肺转移，H&E染色证实。结果显示，与用miR-CON治疗的组相比，系统递送的miR-515-3p寡核苷酸显著降低了肺转移负担（图6b，c），表明miR-515-3p可能是治疗转移癌的潜在治疗分子。
讨论
食管鳞癌是世界第八大常见恶性肿瘤，5年生存率为15.25%。一旦癌症被发现，病人通常处于晚期。尽管已经制定了许多治疗策略，但转移性扩散、耐药性和复发导致癌症患者预后不良。尤其是对于晚期转移性食管癌，目前还没有有效的靶向药物。因此迫切需要寻找预后生物标志物和治疗靶点来改善晚期食管鳞癌的治疗效果。新的证据表明，人类基因组中60%以上的基因受miRNAs调控，miRNAs通过与mRNA结合抑制多个靶基因的翻译，从而在包括癌症在内的各种疾病的生理和病理过程中发挥关键作用。然而，关于功能性microRNAs在食管癌转移中的鉴定却鲜有报道。在本研究中，研究者发现6个候选miRNAs可能参与肿瘤转移，并且发现miR-369-3p、miR-515-3p以及miR-331-5p明显抑制ESCC细胞侵袭（补充图S2b）。在这三种miRNAs中，肿瘤中少见的miR-515-3p成为本研究的重点。目前，miR-515-5p在肺癌和乳腺癌中的作用及其上游调控机制已有报道。已有研究表明miR-515-5p可直接与鞘氨醇激酶1的3utr结合，抑制乳腺癌细胞增殖。此外，在非小细胞肺癌中，miR-515-5p分别通过直接靶向MARK4和CXCL6抑制细胞迁移、存活和转移。这些研究表明miR-515-5p可能是一种有效的肿瘤治疗生物标志物。然而，miR-515-3p在肿瘤中的作用及其机制尚未见报道。在本研究中，首次发现miR-515-3p在转移性ESCC中的异常表达（图1）。由于miR-515-3p的启动子高度甲基化，如全基因组甲基化测序和甲基化特异性PCR所示（图2），miR-515-3p的解除调控可能在功能上与细胞侵袭和转移相关。如图6d所示，在这里首次提出miR-515-3p通过直接结合vimentin和MMP3显著抑制ESCC细胞的侵袭和转移，在研究miRNA在ESCC转移中的机制和功能上具有重要意义。
转移是一个多方面的系统性过程，包含几个基本事件，依赖于癌细胞获得更高的细胞活力、EMT和侵袭性。更好地认识癌症转移关键调节因子的上游机制非常重要。vimentin是EMT的重要标志物，在癌症转移中起着关键作用。MMP3可降解细胞外基质，促进癌症进展，包括侵袭和转移。在此，本研究首次发现vimentin和MMP3是miR-515-3p的靶基因。据作者所知，miR-515-3p在肿瘤中的作用机制目前尚不清楚。研究者证实异位miR-515-3p表达显著降低vimentin和MMP3的表达，而沉默miR-515-3p则增加其表达。还证实了miR-515-3p过表达细胞联合过表达vimentin和MMP3比miR-515-3p过表达细胞单独过表达vimentin或MMP3显示出更高的侵袭和迁移能力，并且几乎完全恢复了miR-515-3p对ESCC侵袭和迁移的抑制作用，暗示vimentin和MMP3可能不相互调节，但在介导miR-515-3p在ESCC细胞侵袭和转移潜能中的作用方面具有明显的相加作用（图5b和补充图S7a）。研究者进一步使用体外和体内实验证明miR-515-3p分别直接结合到vimentin和MMP3的CDS和3-UTR区域，抑制ESCC的侵袭和转移（图3-5)。这些发现从机制上说明miR-515-3p是EMT抑制肿瘤转移的新调节因子，为ESCC治疗提供了一个有用的治疗靶点。
越来越多的证据表明，基于microRNA的治疗可能是一种有效的治疗癌症的方法。目前，单链miRNA抑制剂和双链miRNA模拟物主要通过脂质体和纳米颗粒递送。体内实验表明，利用水凝胶支架包埋的纳米颗粒可以有效地将miRNA递送到肿瘤中，从而显著减少乳腺癌的转移。最近的研究结果还表明，使用聚乙烯亚胺可以系统地输送miRNA模拟物来抑制体内癌症的进展。在这项研究中，鉴于miR-515-3p可以降低vimentin和MMP3的表达，成功输送的miR-515-3p有望同时靶向vimentin和MMP3，对晚期食管鳞癌有较好的治疗效果。动物实验结果证实，静脉注射miRNA-515-3p寡核苷酸可显著抑制小鼠体内的转移扩散（图6），表明miRNA-515-3p在ESCC治疗中的潜在治疗意义。
本研究还表明miR-515-3p是ESCC诊断和预后的一个有用的生物标志物。如图1所示，组织芯片中miR-515-3p表达的原位杂交分析表明，在ESCC中miR-515-3p的下调可以预测淋巴结转移和不良预后。miR-515-3p的表达与食管鳞癌的分期和进展明显相关，与食管鳞癌的生存率更显著相关（图1）。这些结果提示miR-515-3p可能是一个有意义的ESCC生物标志物。
总之，本研究表明miR-515-3p可以通过直接靶向vimentin和MMP3抑制ESCC细胞的侵袭和转移潜能。启动子高甲基化导致食管鳞癌中miR-515-3p表达下调，这与不良的临床病理特征和癌症患者的低生存率相关，暗示miR-515-3p可能是一种新的诊断和预后生物标志物。临床前研究结果表明，miR-515-3p全身给药可抑制肿瘤转移，提示miR-515-3p有望成为ESCC治疗的新策略。
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