A260/A280是测核酸浓度和纯度用的。
用紫外分光光度计测量样品时,不同成分的样品会有不同的吸光度。
260纳米(nm)是核酸的最高吸收峰的吸收波长,280nm则是蛋白和酚类的。
纯DNA的A260/A280=1.8
纯RNA的A260/A280=2.0
当样品被蛋白质或者酚污染的话,A260/A280值会下降;
核酸最高吸收峰的吸收波长最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。
OD260/280比值指260nm和280nm下吸光光度比值。OD是optical density(光密度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度, OD=lg(1/trans),其中trans为检测物的透光值。
一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值,而OD是光密度值,一个意思。
OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多,纯度已经很高了。
纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染)
纯RNA:1.9 <OD260/OD280<2.0(2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。
提取RNA时分层现象:RNA提取时,加氯仿后分三层:水相(含rna,可能还有少量DNA),中间白色薄层(应该是蛋白和DNA),下层有机相(氯仿和蛋白等)
RNA提取条件较DNA严格,主要是因为样品及环境中,存在大量的RNase,而RNase较耐高温,不易失活,因此在提取RNA时,需要避免内外源RNase的污染,这是保证RNA成功提取的关键所在。
去除DNA、蛋白质、盐离子等杂质,保证核酸纯度。260/280在1.8-2.1之间,小于1.8有蛋白污染,大于2.2有RNA降解。260/230最佳2.0以上,小于2.0有盐类、有机溶剂等污染。
Trizol作用原理:
在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可从中间相沉淀得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
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