近期，日本北海道大学药学院的YusukeSato及Hideyoshi Harashima研究团队在《Journal of Controlled Release》期刊2021年第330期上以“ Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein–oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editingand hepatitis B virus inhibition ”为题发表了文章。
CRISPR/Cas系统具有强大的治疗性基因组编辑潜力，可用于治疗包括乙型肝炎病毒（HBV）感染在内的各种顽固性遗传病和传染病，但是在制剂合成方面的困难以及递送效率差等问题严重阻碍了治疗性基因组编辑的发展。
作者在这项研究中使用了一种微流控设备，合成了用于递送CRISPR/Cas核糖核蛋白（RNP）的脂质纳米颗粒（LNP），避免了Cas酶的聚集并保持了其DNA裂解活性。该制剂具有出色的基因断裂（高达97％）和碱基替换（高达23％）能力，可以显著抑制HBV的感染，同时没有任何明显的细胞毒性。
在用微流控设备制备LNPs的过程中，脂质溶解在乙醇中，RNPs悬浮在酸性缓冲液中，两者在微通道中快速混合。这种混合导致阳离子脂质和带负电荷的RNPs之间产生静电相互作用，随后形成LNPs。
作者成功确定了维持Cas9 RNPs的DNA裂解活性所需的最佳流动条件（包括总流速、流速比和缓冲液pH）。同时，作者发现通过使用带有3个入口的微流控装置——从注入脂质和RNPs溶液的两个入口之间的中心入口处引入缓冲溶液，可以避免Cas9 RNPs在混合前短时间暴露于高浓度乙醇而发生聚集。
图1：微针在免疫治疗中的不同策略
该脂质纳米颗粒的配方由4种类型的脂质组成，包括pH敏感型阳离子脂质(CL4H6)、磷脂(PL)、chol和PEG-DMG。作者通过两步多反应实验设计(DOE)确定了LNP的最佳处方，即B-4-LNPs（CL4H6/DOPE/chol/PEG-DMG=40/20/40/2 mol%）和B-9-LNPs （CL4H6/DOPE/PEG-DMG=50/50/2 mol%）。
作者还发现单链寡核苷酸（ssON）可以增强Streptococcus pyogenes Cas9 RNPs的递送。作者通过实验证明ssON并不会影响细胞对于Cas9蛋白的摄取，因此他们推测ssON可能是通过增加LNPs中Cas9蛋白的含量，并避免其在培养基和内含体中的降解来增强spCas9 RNPs的递送。
此外作者还考察了ssON（特别是ssDNA）对脱靶效应的影响，T7E1法的检测结果表明添加ssDNA并没有导致脱靶效应的增加。作者还应用了类似的策略来递送Cpf1 RNPs，Cpf1 RNPs的RNA是一个41 nt的crRNA，比spCas9的RNA(长度约100 nt)短很多。
Cpf1RNPs的这一特性导致其负电荷密度较低，可能不利于其被LNPs包封并导致递送效率低下。通过将Cpf1 RNPs与ssRNA复合，提高了Cpf1 RNPs的负电荷密度，从而显著地提高了其基因敲除活性。同时，实验结果显示总RNA长度(crRNA和ssRNA长度之和)与基因敲除活性呈很强的正相关关系，这清楚地表明了RNPs的较高负电荷密度有助于与LNPs形成更稳定的结构。
图2. ssON的长度对RNP递送的影响
为了验证经优化的制剂是否可以诱导有效的基因敲除，作者使用了由于RuvC域突变而只切割目标链的D10A Cas9n，并设计了一对与GFP位点相反链互补的9 nt偏移crRNA，用B-9-LNPs递送后在HeLa-GFP细胞中产生了显著的GFP敲除效果。然后作者将spCas9 RNPs进一步与ssDNA复合后用于诱导产生HDR介导的碱基替换，以将EGFP基因转化为BFP基因，实验结果表明包载spCas9 RNPs的LNPs在HEK-GFP细胞中显示出较强的EGFP敲除活性，EGFP−BFP+细胞也以浓度依赖的方式产生，在spCas9 RNPs的浓度为5 nM时达到了23%，与电穿孔法产生的效果相当。
图3. 优化后的LNPs通过双缺口策略和HDR介导的碱基替换诱导基因KO
HBV是一种双链DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要病因，全球有超过2.4亿人感染慢性乙肝。目前批准的用于治疗HBV感染的药物包括核苷/核苷酸类似物和干扰素，前者可抑制HBV逆转录，后者可刺激患者免疫系统清除被感染的肝细胞。
虽然这些药物有助于抑制HBV相关肝病的恶化，但它们很难在慢性乙型肝炎患者体内持续清除HBV。因此为了完全治愈慢性乙型肝炎，需要一种新的治疗策略，以使共价闭合的环状DNA（cccDNA）失活，该环状DNA稳定地存在肝细胞核中，并在病毒潜伏和重新激活中起关键作用。
为了研究包载Cas9 RNPs的LNPs是否具有抑制HBV的能力，作者将被HBV感染的HepG2-hNTCP-30细胞连续12天，每隔3天用包载Cas9 RNP的B-9 LNPs处理，实验结果表明其对HBV DNA和cccDNA的抑制率分别约为60%和80%，显著高于AAV2组，并且没有观察到明显的细胞毒性。这些数据表明，包载RNP的LNPs是一种治疗慢性HBV感染的新策略，可以抑制或清除HBV DNA和cccDNA。
图4. 包载Cas9 RNP的B-9-LNPs对HBV的抑制作用
在这项研究中，作者首次通过微流控装置，合成了包载CRISPR/Cas RNP的LNPs。通过ssON增加了RNP的负电荷密度从而显著增强了Cas9和Cpf1 RNP的递送。与AAV2相比，该优化的制剂表现出了强大的基因断裂和碱基替换能力，并显著抑制了HBV DNA和cccDNA，并且没有观察到任何明显的细胞毒性。这些发现将极大地促进RNP递送技术的发展及未来在临床中的实际应用。
第一作者：
Yuichi Suzuki，日本北海道大学药学院分子药物设计实验室。
通讯作者：
Yusuke Sato及Hideyoshi Harashima，来自日本北海道大学药学院分子药物设计实验室。
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