线粒体碱基编辑器实现小鼠体内mtDNA编辑，剑桥大学线粒体遗传专家：未来或可代替「三亲婴儿」疗法
线粒体为我们的生命活动提供了源源不断的能量，它是细胞的 “能量工厂”。其内部有一套独立于细胞核以外的遗传物质 —— 线粒体 DNA（mtDNA，又被称为 “人类第 25 号染色体”），是一种半自主性的细胞器。人类线粒体 DNA 占整个人类基因组的 0.1%，大小约为 16569bp，含有 37 个基因，共编码 13 种蛋白质。这些蛋白质主要用来参与细胞的能量代谢，对人体的生命活动至关重要。线粒体的遗传物质发生突变同样会带来遗传性疾病，例如已知的线粒体肌病、母系遗传 Leigh 综合征、Leber 遗传性视神经病、共济失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等几十种遗传疾病。这些疾病在很大程度上无法治愈，且通常是致命的疾病。据统计，大约 5000 人中就有 1 个人深受线粒体疾病的折磨。针对线粒体疾病，目前没有可以治愈的治疗方法。值得一提的是，线粒体疾病是一种母系遗传疾病，线粒体几乎全部由母亲传递给子女。当母亲确诊 mtDNA 突变时，一种被认为是最根本的治疗方法就是纠正卵细胞，即 “三亲婴儿”，胚胎的 DNA 来自三个人：父亲提供精子、母亲提供卵细胞核、女性捐赠者提供去除细胞核的卵细胞。2015 年，英国成为第一个批准合法实施 “三亲婴儿” 技术的国家；2016 年，华人医学博士张进（John Zhang）缔造了全球第一例 “三亲婴儿”。图 | 世界第一例 “三亲婴儿”（来源：mouthsofmums.com）除此之外，科学家们还在研究针对线粒体疾病的基因治疗。谈起基因治疗，就离不开基因编辑工具。传统的三大基因编辑技术 CRISPR Cas9、TALEN 和 ZFN 主要作用于细胞核中的基因，对于线粒体中基因的编辑存在着很大的问题。CRISPR Cas9 系统一般包括一段人工合成的 Guide RNA 和 cas9 酶，而 RNA 不能进入线粒体，因此，CRISPR Cas9 技术不能对线粒体基因进行编辑。目前改造线粒体 DNA 的方法主要是利用无 RNA 系统的核酸酶。转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）系统和锌指核酸酶（ZFN）系统都是通过识别特定的 DNA 序列进行工作的，因此可以进入线粒体发挥基因编辑的作用，但是这两种技术存在一个缺陷就是，它们都是通过将携带的突变 mtDNA 直接降解来消除突变的。这会使得 mtDNA 拷贝数降低，而 mtDNA 拷贝数的降低可能会在实际疾病治疗中带来更多的风险。基于以上原因，一种专门用于线粒体的碱基编辑工具的开发迫在眉睫。2020 年 7 月，基因编辑领域知名科学家、哈佛大学和 Broad 研究所教授 David Liu 的团队在 Nature 上发表了关于线粒体基因编辑技术的最新研究进展，开发出了首个 “线粒体 DNA 精确编辑的分子工具” 。线粒体碱基编辑器 DdCBE（derived cytosine base editor）的建立，是基于细菌毒素 DddA 的发现。在研究细菌如何利用毒素互相攻击时，科学家发现一种对单链 DNA（ssDNA）没有效果的脱氨酶，它可以直接作用于双链 DNA（dsDNA），将其中的胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U），从而杀死细菌，这种细菌毒素被命名为 DddA（double-stranded DNA deaminase toxin A，双链 DNA 脱氨酶毒素 A）。这种细菌毒素对于人体细胞是有毒的，如果不加以控制，它将肆意破坏 DNA，将遇到的所有胞嘧啶（C）都进行突变。经过被 David Liu 称之为 “驯服野兽” 的改造后，在模式细胞人类人胚胎肾细胞 HEK293T 中，研究人员证实了 DdCBE 系统的编辑能力。他们测试了线粒体基因组中的 5 个基因，处理 3~6 天后，碱基编辑效率在 4.6%~49%，脱靶效应基本也在 0.05% 以下。近日，在 Nature Communications 刊登的一篇论文，证明了 DdCBE（derived cytosine base editor，一种线粒体碱基编辑工具）可以在成年和新生小鼠中进行所需的线粒体 DNA 编辑。这项概念验证研究来自剑桥大学 MRC 线粒体生物学部门的研究员 Michal Minczuk 的实验室。（来源：Nature Communications）在这项研究中，研究人员通过使用腺相关病毒（AAV）载体将 DdCBE 递送到小鼠心脏，在成年和新生小鼠中进行所需的线粒体 DNA 编辑，均得到了相应的表达结果。“这是第一次有人能够改变活体动物线粒体中的 DNA 碱基对”，Minczuk 实验室的博士后研究员 Pedro Silva-Pinheiro 博士指出， “这表明，原则上，我们可以进入并纠正有缺陷的线粒体 DNA 中的拼写错误，从而产生健康的线粒体，使细胞能够正常运作。”Minczuk 指出：“在我们的疗法能够治疗线粒体疾病之前，显然还有很长的路要走。但它表明，未来的治疗有可能消除线粒体替代疗法的复杂性，并允许在儿童和成人中修复有缺陷的线粒体。”而就在前不久，我国学者在 Cell Discovery 上发表了题为 “Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE” 的研究论文，证实了 DdCBE 可在人类早期胚胎中实现高效的线粒体碱基编辑，并且在 8 细胞胚胎中的效率要高得多。尽管距离应用到临床还有很长的路要走，但现在我们已经看到了黎明前的曙光，这将为线粒体疾病的治疗提供一种更为有效的办法。- https://www.genengnews.com/news/base-editors-modify-mitochondrial-genome-in-live-mice/
- https://mouthsofmums.com.au/the-worlds-first-three-parent-baby-with-three-sets-of-dna/
- https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4
- https://www.nature.com/articles/s41467-022-28358-w
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