基因疗法的出现为很多难治遗传疾病的治愈带来希望。然而，基因疗法存在免疫原性等潜在危险因素，同时目前基因疗法大多采用病毒作为载体进行递送，较大的基因难以进行包装，这些难题阻碍了基因疗法的进一步应用。
近期，麻省大学医学院的研究人员揭示了一种通过重组腺相关病毒（rAAV）体内递送无义突变抑制性 tRNA（suppressor-tRNA）的通读治疗策略，解决了难以包装和免疫原性的问题，而且同一种分子可能治疗多种无义突变引发的疾病，为基因治疗开辟了新的思路。这项研究论文已于近日发表在 Nature 上。
（来源：Nature）
“这种基因治疗策略在小鼠模型中安全有效地治疗了由无义突变引发的遗传疾病，并且在一次治疗后的疗效持续了 6 个月以上。” 该论文的通讯作者、麻省大学医学院王丹教授告诉生辉。
王丹本科就读于复旦大学，主修生命科学专业。毕业后，他进入阿拉巴马大学伯明翰分校攻读博士学位，研究方向是遗传学和基因组学。博士期间，他研究的一个课题是用小分子药物诱导无义突变的通读。随后，王丹进入麻省大学医学院基因治疗中心从事博士后研究，师从全球 AAV 基因治疗领域的领导者高光坪教授，从事 AAV 基因治疗相关研究工作。
图｜麻省大学医学院王丹教授（来源：受访者提供）
“我博士期间研究的是小分子药物通读治疗，博后期间研究的是 AAV 基因治疗，最新的这项研究其实是把'通读治疗’和'基因治疗’进行了有机结合。” 王丹说道。
基于抑制性 tRNA 开发基因治疗新策略
无义突变是由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子（UAA、UAG 或 UGA），从而使肽链合成提前终止，形成一条不完整的多肽链，导致蛋白质的生物活性和功能改变，引发基因相关疾病。目前，大约有 10-15% 的人类基因相关遗传疾病是由于无义突变引发的。
tRNA，又称转运 RNA，是一种由 76-90 个核苷酸组成的 RNA。tRNA 可以 “读出” mRNA 上由三个核苷酸构成的密码子，然后将对应的氨基酸运送到核糖体上，最后这些氨基酸串联形成蛋白质。
图｜tRNA 结构（来源：维基百科）
抑制性 tRNA 与天然 tRNA 的大部分序列相同，但其反密码子可以通过碱基配对识别终止密码子，并将正确的氨基酸插入到正在合成的肽链中，诱导无义突变的通读，从而获得拥有正常功能的全长蛋白。
在这项新研究中，王丹团队通过改造近同源的 tRNA 得到能够荷载相应氨基酸的抑制性 tRNA，并通过体外基因实验证实了抑制性 tRNA 对无义突变的有效通读和相应氨基酸在翻译过程中的插入。
他们通过重组腺相关病毒将抑制性 tRNA 递送到黏多糖贮积症 I 型（MPS-I）无义突变的小鼠体内，试验显示能够降低黏多糖过度积存，实现对该病症的有效治疗。长程跟踪试验结果显示，其疗效可以持续超过半年以上。除此之外，抑制性 tRNA 的治疗没有影响小鼠体内内源的 tRNA 稳态，小鼠的生理生化指标均正常，表明这是一种较为安全的基因治疗策略。
图｜该基因治疗策略实现对 MPS-I 小鼠的有效治疗（来源：论文）
对于这项研究的初衷，“主要是源自于课题组在开展 AAV 基因治疗过程中遇到的一些问题。” 王丹说道。
首先，AAV 载体所能够包装的容量是受限的（一般在 5000 个碱基以内），较大的基因难以包装到 AAV 蛋白外壳里，这就限制了基因疗法在很多遗传病中的应用；
其次，用 AAV 表达外源基因可能会造成毒性。比如，在原本不该表达的位置进行表达，或者是表达的量过高，都可能会造成毒性；
最后，表达基因编辑的一些蛋白，比如 Cas9 蛋白，可能会造成免疫反应，这对基因治疗是很不利的。
“考虑到现阶段 AAV 基因治疗所面临的这些痛点，我们试图通过一种方法来克服或绕过这些问题。结合我在博士期间的研究方向，决定尝试利用 AAV 递送抑制性 tRNA 的策略，针对无义突变开发一些基因疗法。” 王丹表示。
谈及在开展这项研究所遇到的挑战，王丹表示，“关键在于既要证明这种治疗策略在动物体内安全、有效。”
针对安全性，王丹团队利用基因组层面的测序方法进行了一系列验证。“tRNA 测序方法是我们实验室之前从未涉及的领域，通过学习与合作，我们掌握了前沿的测序技术和数据分析方法，为证明安全性提供了很好的工具和平台。” 他指出。
针对有效性。“我们用 AAV 设计了多种表达载体。比如采用一个、两个、四个拷贝的抑制性 tRNA。经过一系列地试验优化最终发现两个拷贝的抑制性 tRNA 效果最好，其他要么表达量不够，要么会造成 AAV 载体基因组的重组。” 王丹表示。
解决传统基因疗法痛点，长期疗效有待验证
据介绍，和传统的 AAV 基因治疗相比，这种基因治疗策略的优势主要体现四个方面。
第一，易于包装。传统 AAV 基因治疗的局限性很大程度上是由于基因太大以致无法包装到 AAV 里面。相较之下，这种治疗策略编码抑制性 tRNA 分子的基因较小，可以较为容易地采用 AAV 载体进行包装和递送。
第二，无毒副作用。这种治疗策略是将细胞本身原有的 mRNA 作为分子的底物，理论上不会出现过表达，或在其他细胞、组织中表达所造成的毒副作用。首先，组织或细胞要能够原本地表达靶向的 mRNA，这种抑制性 tRNA 才会起效；其次，由于细胞本身的 mRNA 是作用底物，所以也不会出现过表达的情形。“我们的这个研究能够充分地利用细胞本身的一些基因表达调节的机制。” 王丹指出。
第三，没有免疫原性。与基因编辑的方法相比，目前应用最广泛的是 CRISPR 基因编辑技术，Cas9 蛋白源自于微生物，对人体而言属于外源性蛋白，会造成免疫原性，可能会带来副作用。而这种治疗策略只表达 tRNA，不表达蛋白，所以不存在免疫原性方面的问题。
第四，治疗更精准。从一个无义突变到恢复全长蛋白的表达，需要保证在无义突变位点插入的氨基酸能够恢复蛋白功能，若是插入错误的氨基酸则会导致蛋白结构不稳定、功能失效等。小分子药物的通读方法虽然能够使得无义突变的基因能够合成全长蛋白，但小分子无法控制插入的氨基酸类型，导致氨基酸的插入存在不确定性。“与之相比，这种治疗策略具有很好的操控能力，能够有选择性地、准确地插入一个特定的氨基酸。” 王丹指出。
另外，他也表示，“我们开发的这种基因治疗策略虽然是基于 MPS-I 动物模型研究出来的，我们希望同一种治疗分子可以应用到由其他（无义突变导致的）遗传病，而且这对于药物开发也是一大利好。”
对于这项研究目前存在的一些问题，王丹表示，“现阶段，我们开发的这种治疗策略还存在一些未知，比如疗效方面和安全方面都有进一步研究的空间。疗效方面，尚不明确这种疗法在多种组织或者细胞类型中的作用效果如何，尤其是其他基因引起的遗传病，还需要进一步探究。安全方面，目前已经在小鼠肝脏中进行了比较深入的研究，至于在其他的组织或者细胞类型当中，以及其他物种当中有没有副作用，也是需要进一步试验探索。”
图｜该基因治疗策略在小鼠体内产生长期（>6 个月）的治疗效果（来源：论文）
“进行一次基因治疗就可以长期有效，而这方面需要更长的时间进行验证。在我们试验的小鼠上，已经证明了半年有效，至于一年、两年、乃至十年疗效如何，则需要更多的数据来证明。” 王丹表示。
基因治疗的临床转化研究
王丹实验室现阶段主要开展 AAV 基因治疗领域的研究工作，主要涉及到的四个方向：
第一，针对某一种或者某几种罕见遗传疾病，开发独特的基因疗法；
第二，“分子治疗平台” 的研究。“我们希望通过抑制性 tRNA 这种分子，打造成为一个'分子治疗平台’，能够实现多种遗传疾病的治疗。” 王丹解释说。
第三，AAV 载体的生产。“因为目前在临床转化的过程当中，AAV 载体的生产是一个瓶颈，至少对很多的应用而言是一个瓶颈。” 他表示，“所以我们想通过一系列的方法来更有效的、更节省资源的生产 AAV。”
第四，基于 AAV 的基础生物学的研究。在王丹看来，“好的应用转化源自于基础生物学，所以我们也在这方面进行探索和尝试。”
（来源：Pixabay）
关于下一步的研究动向，王丹表示，一方面，AAV 的蛋白外壳需要进一步探索。“比如，研究针对不同细胞或者组织类型具有特异感染能力的蛋白外壳，包括能降低免疫原性的蛋白外壳等。” 王丹解释说。
另一方面，用 AAV 表达基因是目前主流、有效的基因治疗方法。“未来的工作重点是要实现更可控制的表达。” 王丹表示。比如，AAV 表达基因并非表达量越高越好，也不是表达范围越广越好、表达时间越长越好。“如何实现从时间、空间层面精准地控制 AAV 表达目标基因，这也是我们重点研究的方向。” 他补充说。
除此之外，基因疗法造成的免疫反应也是一大挑战。原理上来讲，基于病毒的基因疗法是把病毒或与病毒类似的药物递送到人体内。“怎样让基于病毒的基因疗法和人类自身的免疫系统能够实现更好的协调，这是一个需要克服的问题。” 王丹指出。
对于这项研究实现临床转化应用还需要解决的问题，王丹表示，现阶段的试验基于小鼠模型。基因疗法在小鼠和非人灵长类动物（甚至人类）中，其治疗效果往往是大相径庭的。“所以，我们希望把这种基因疗法在非人灵长类动物中做进一步的测试，尤其是针对安全性，这是转化中至关重要的环节。” 他指出。
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