2009 年，一篇关于单细胞 mRNA 测序的研究论文在 Nature Methods 上发表，自此全面拉开了单细胞测序产业发展序幕。
单细胞测序是在单个细胞的水平上对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析的一项新兴技术，作为近十年来生命科学领域的一项重大技术，其应用前景被广泛看好。与此同时，全世界越来越多的企业涌现并加入这一赛道，行业竞争日趋激烈。
在全球范围内对比，国内单细胞测序产业起步稍晚，技术、产品以及市场份额等都被海外公司所主导。为了避免将来被“卡脖子”，国内企业从源头开始自主研发单细胞测序技术和产品很有必要。
作为一家以创新技术为驱动力的企业，墨卓生物基于液滴微流控技术积淀从源头创新，自主开发端到端的高通量单细胞测序完整解决方案，从技术到产品全链条推动国内单细胞测序产业发展进程。
近日，生辉邀请到墨卓生物 CTO 郑文山博士，围绕源头创新、产品、技术、产业等多个维度来对单细胞测序行业进行解读。
从北京大学化学系本科毕业之后，郑文山进入哈佛大学攻读博士学位。他本科的研究方向为纳米材料合成。“当时我研究的课题虽然不属于生物技术，但本质上是属于方法学开发。截至目前，这也一直都是我的研究方向——在不同领域的方法学开发。”他说道。
在哈佛大学，郑文山师从美国三院院士、中国工程院外籍院士 David Weitz 教授。David Weitz 教授是液滴微流控领域奠基人之一，也是将液滴微流控应用于高通量单细胞测序技术的发明人。
郑文山博士期间的研究方向主要围绕液滴微流控领域，比如采用液滴微流控进行高通量单细胞测序，包括真核生物转录组和微生物基因组等。目前，他已在 Science、Nature Communications 等高水平国际期刊上发表论文十余篇。
谈及创立墨卓生物的初衷，郑文山坦言，在哈佛大学求学期间，他与另外两位创始人裴颢博士、刘寒博士都希望能够产生一些大而正向的影响：把所学知识应用到产品开发，以此来帮助和惠及更多的人。“哈佛大学的创业氛围非常浓厚，而且哈佛大学所在的波士顿是全球生物科技创业的圣地，我们在求学期间受到了很多这方面的熏陶和影响。”他补充说。
2018 年，他们在美国波士顿的哈佛大学校园联合创立了墨卓生物。
▲图｜墨卓生物创始人团队，从左至右分别为首席运营官刘寒、首席执行官裴颢、首席技术官郑文山（来源：公司官网）
之所以选择回国落地，“首先，我们看到在国内，生物技术领域和国外还存在一定差距，我们希望能够用实际行动，为推动国内生物技术产业进步贡献一份力量；其次，国内整体环境大力支持创业创新，包括国家政策和地方政策都非常利好；再次，国内周边配套，不论是硬件设施还是科研团队等都已经非常健全完善，在国内发展前景更为广阔。”郑文山表示。
怀揣这份热忱，他们于 2020 年回国，并将墨卓生物落地浙江嘉兴。
▲图｜墨卓生物（来源：公司官网）
目前，郑文山担任墨卓生物的首席技术官，专注于创新技术研发，David Weitz 教授是公司的首席科学家。“液滴微流控是墨卓生物的核心技术，这也是我在博士期间跟随 David Weitz 教授的主要研究课题，即液滴微流控技术在生命科学领域的应用和技术开发。”郑文山表示。
在郑文山看来，墨卓生物是一家真正以用户需求为本、以产品为中心的生物技术公司。“我们团队内部思路高度一致，贯彻以产品为中心的企业理念，通过深入挖掘用户的需求，各个部门齐心协力开发高质量、高完成度的能够切实满足用户需求的创新产品，服务生命科学，造福人类健康。”他说，“'用生命科学服务人类健康’，这既是公司的愿景，也是我们自己的一个愿望。”
今年，是墨卓生物首套产品的商业化元年。
作为一家以产品为中心的生物技术公司，墨卓生物历时数年打造的首套产品——MobiNova® 高通量单细胞转录组解决方案已于今年4月上市。
▲图｜墨卓生物 MobiNova® 高通量单细胞转录组解决方案（来源：公司宣传资料）
MobiNova® 高通量单细胞转录组解决方案是一套覆盖了仪器、试剂和生信分析软件的完整解决方案，由 MobiNova®-100 高通量单细胞测序建库系统、MobiCube® 高通量单细胞转录组试剂盒和 MobiVision® 生信分析软件组成，全流程覆盖高通量单细胞转录组实验的需求。
据了解，MobiNova® 高通量单细胞转录组解决方案的细胞分群质量与国际主流产品质量不相上下，细胞捕获率达 70%，且可捕获稀有细胞类型，每 10000 个细胞中多胞率<5%。
达到高水平的性能指标，在郑文山看来，主要是得益于墨卓团队的技术积累。“采用液滴微流控技术来进行高通量单细胞测序，这其实也是我们墨卓创始人 David Weitz 团队的首创。从微流控技术的发明到后续的拓展应用研发，多年来我们拥有深厚的技术沉淀和经验积累。”他说，“而在实际的产品开发中，由于整套产品体系比较复杂，因此还需要仪器、微流控芯片、试剂、生信等各个端口相互高度协作配合，实现对于每个端口的精准控制。这就要求我们进行自主的、从零开始的设计、研发以及产业化。”
具体而言，“我们通过优化微流控芯片的设计和仪器控制，在液滴生成时稳定实现细胞分离和微球、试剂、细胞的共包裹，从而达到较高的细胞捕获率。同时，通过液滴的高速生成来确保每 1 万个细胞中的多胞率控制在 5% 以内。”郑文山介绍道。
此外，不同批次数据稳定性和实验的可重复性向来是行业痛点，也是最难解决的挑战之一，因为这是对综合性能的考量，既需要仪器足够精密，也需要试剂足够稳定，甚至对实验流程的方便性都有极高要求。放眼整个科研仪器和体外诊断行业，国产仪器与进口仪器的最大差距正是于此。
MobiNova® 单细胞转录组解决方案的不同批次数据稳定性和实验的可重复性亦是达到国际领先水平。对此，郑文山表示，“正如刚才提到的，整套系统的仪器、微球试剂、生信软件、微流控芯片等，各个端口之间需要紧密配合，大到核心部件，小到一个工序，我们全部都是从源头做起，进行自主研发生产，因此能够实现对整个流程的精准把控，所以我们产品得到的实验数据具有很高的稳定性，批次内稳定性和批次间稳定性都非常高。”
“总而言之，我们拥有完整的自主知识产权，整个系统全都可以在内部进行研发和改进，因此，我们能够通过不断的打磨产品，从而实现较高的性能参数指标，与国际主流产品质量平齐。”郑文山总结说。
打造一款卓越产品自然离不开先进技术的加持。
就目前而言，高通量单细胞测序主要有两大技术路线，一个是微孔法，一个是液滴法，两条技术路线各有千秋。
作为墨卓生物的核心技术——液滴微流控，其优势是把每个液滴都变成一个个微型“反应器”，能够大幅提高通量、降低成本。郑文山表示，“在读博期间，我就希望能把液滴微流控技术真正地实现产品化，而将液滴微流控用于开展高通量生物学实验便是一个非常好的应用方向，可以让更多用户使用到这种先进技术，为生命科学研究提供助力。”
▲图｜墨卓生物试剂研发实验室（来源：公司官网）
为了保证产品的优越性能和稳定性，墨卓生物在已有的液滴微流控技术基础上进行了进一步的创新，自主研发了细胞和试剂“分区”设计、微球包裹高速流道，以及 Lightcut™ 光激发分离三大创新技术。
据了解，细胞和试剂“分区”设计是为样本细胞设计了一条独立的流道，因而将原来的 2 个水相流道和 1 个油相流道，增加到了 3 个水相流道和 1 个油相流道，能够最大程度减少对细胞的干扰。
“这样设计的难点在于，更多的流道之间会产生更多的相互作用，从原来 3 个流道的两两相互作用，变成 4 个流道的两两和三三相互作用，整体复杂度多了数倍，控制难度大幅增加，而且对于微流控流道设计、液滴的生成，芯片表面修饰等都提出了更高的要求。”郑文山介绍道，“微流控领域是墨卓生物团队的专长，我们针对这个难题进行技术攻关并妥善解决，目前，在现有的系统上能够实现高稳定性液滴的生成。”
对于包裹微球的高速流道，“这里的高速，指的是生成液滴的频率比较高，意味着能够在单位时间内生成更多的液滴。”郑文山指出。想要实现高速，他总结了以下 3 个方面：
第一，结构设计。流道的结构设计要能非常稳定地生成液滴。
第二，表面疏水。“流道的表面进行疏水处理，比如我们目前使用的是'油包水’的液滴，这对芯片表面修饰提出很高的要求。”他解释说。
第三，系统控制。比如对系统的压力参数等实现精密的调控。
“最终，在这三个方面的协调配合下，我们的产品可以实现每秒钟生成几百到几千个液滴。”郑文山说道，“这样的速度可以大幅缩短上机时间，提升实验效率，可以极大地减少 mRNA 在实验过程中降解的可能性，获得更稳定和优越的实验结果。”
“而在液滴生成后，我们期望在液滴内部进行的反应是一个'均相反应’，即引物与需要捕获的 mRNA 分子都在水相中，所以，我们需要把微球上连接的引物释放出来。”他指出。
据介绍，传统的方法是不进行释放，但是界面反应会降低反应效率；另一种方法是把微球进行溶解，但是微球里面复杂的成分会进入到体系中，对体系内的 mRNA 反转录效率等方面可能产生严重干扰。
上述两种方法都存在局限性，相较之下，“我们的新方法是在微球和引物之间加入一个新的对特定波长的光敏感的连接键，在经过特定光的激发之后，引物就会可控地释放出来，这就是 Lightcut™ 光激发分离技术。”郑文山解释说。
细胞和试剂“分区”设计、微球包裹高速流道和 Lightcut™ 光激发分离这三大自主开发的创新技术，让墨卓生物的产品拥有了更进一步的优越性能和稳定性。目前，这三大技术已全部应用在 MobiNova® 高通量单细胞转录组解决方案中。
除了应用于动植物的单细胞测序领域，墨卓生物近期在微生物单细胞领域也取得了创新突破。
今年 6 月，郑文山作为并列第一作者在 Science 发表了题为“High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome”新研究论文，开发出微生物高通量单细胞基因组学技术——Microbe-seq，这是微生物群落研究方法学上的一项重大突破。而就在去年，国家自然科学基金委在其项目指南中也明确提出了鼓励开展微生物单细胞的研究。
▲图｜相关论文（来源：Science）
相较于目前常规的微生物菌群宏基因组测序技术，高通量单细胞测序技术具有压倒性优势。据郑文山介绍，一个微生物群落样本中往往包含各种不同的微生物，其构成非常复杂，其中不同的物种可达上百甚至几千种。传统的宏基因组方法是把所有的核酸从所有的微生物中提取出来再进行测序，而每一段核酸的序列来自于哪个微生物细胞，在实验端无法进行特殊处理，只能借助生信端来进行分析，具有一定的局限性。
相较之下，单细胞测序则可以把每一个细菌内的核酸标记一个特殊的编码，测序完成之后能够把它的序列再重新进行关联起来，如此一来，在实验端就已经把“哪些序列来自哪个微生物细胞”的难题解决，大幅提升了结果的精准度和可靠性。
因此，这种针对微生物的高通量单细胞测序技术，能够让科研工作者真正深入地去研究微生物菌群基因组学，把测得的每一个序列之间的关联性阐释清楚，得到的结果也会更加可信，由此还可以去拓展研究一些复杂的微生物群落的特征。
相较于动植物的单细胞测序侧重于转录组，墨卓现阶段微生物的单细胞测序侧重于基因组，对此，郑文山表示，“对于微生物的组学而言，目前的研究还是相对偏早期，即使要研究转录组，也往往需要先获取高质量的基因组信息作为基础。因此这个阶段对于微生物基因组的需求相对更大一些。”
两种技术既有交叉，也有不同。具体而言，“在我们开发的体系中，两者都采用液滴微流控技术，而液滴在这个过程中充当“高通量反应器”的功能。高通量单细胞测序，我们会在液体内部把每一个细胞的核酸（RNA或DNA）采用分子标签（barcode）进行标记，如此一来，每个细胞的核酸都会有一个 DNA 序列（分子标签）与之相关联，这是两项技术在原理上的相似之处。”郑文山介绍说。
不同点则体现在多个方面，比如，细菌的单细胞测序需要在微流控体系内把细胞壁打破，而对于动植物细胞来说，动物细胞没有细胞壁，植物细胞一般在上机前就已经完成了破壁，不需要在微流控体系中纳入破壁的步骤。“此外，动植物的单细胞转录组测序关注的是 mRNA，mRNA 会有一段 poly A 序列作为一个通用的固定接头，可以比较容易地被捕获。但细菌的基因组是连续和相对随机的，它没有固定的序列可以用来作为捕获接头，所以我们在这个流程中还需要去给它的基因组添加作为捕获接头的序列。”郑文山解释说。
“还有非常关键的一点，mRNA 的长度会短一些，一般为数百到数千个碱基，一般情况下，测几十个碱基就能够确定基因。相较之下，基因组则很大，一般有数百万个碱基，所以，这就需要把它打断到一个比较合适于进行测序的长度。所以，微生物菌群的高通量单细胞测序会面临很多新的技术挑战。”他补充说。
▲图 | 微生物高通量单细胞基因组测序实验原理（来源：Science）
在郑文山看来，“高通量单细胞测序技术本身是一个比较革新性的、能够从新的维度和分辨率来研究生物学问题的方法，是属于比较底层的技术革新。所以，关于微生物研究中的方方面面都能够受益于高通量单细胞测序技术。”
因此，传统采用宏基因组学进行研究的应用场景，都可以使用微生物高通量单细胞基因组学来进行更加深入的研究，可以更好地分析一个复杂的微生物样本中都有哪些微生物、其基因组序列是什么、有哪些潜在功能等等，还可以探索微生物对人体健康的影响，例如分析微生物在癌症治疗中对预后的影响。同时，在农业中，土壤微生物也与农作物的生长密切相关，通过微生物高通量单细胞测序可以更好地分析它们的关联性和因果关系，帮助提高农业产量、抵御病害等。
除了传统应用场景外，新技术也让微生物研究能够触及到以往技术所不及的地方。例如，由于微生物高通量单细胞基因组测序能够获得更加完整、精准度更高的细菌基因组序列，因此不仅能够更加精准地分析样本中的不同菌种，还能分析同一菌种中有哪些不同菌株，甚至深入分析不同菌株的功能差异。同一菌种的不同菌株在致病性、功能、代谢通路方面可能大相径庭，因此这对于农业、环境和临床医学都有着非常重要的意义。
对于该技术的转化，“我们目前已经搭建了一整套的实验平台，能够为客户提供科研服务支持，与之配套的仪器和试剂也都在开发中，我们希望在两年内能够推出针对于微生物高通量单细胞测序整套仪器、试剂、芯片和生信软件的解决方案。”郑文山表示。
就现阶段而言，限制单细胞测序技术广泛应用的瓶颈之一是价格过于昂贵。比如，目前国际市场占有率较高的公司，进行单个样本实验的试剂成本已超 1 万元人民币，因而进行一组简单的生物实验花费多达 10 万元人民币以上。所以，市场对于“降本”的需求非常强烈。
据介绍，围绕整体解决方案的“降本”，墨卓生物开展大量研究工作，主要涵盖 3 个层面：
第一，技术优化改进。“针对一些关键步骤，我们通过提高产率，比如把产率提高 5-10 倍，那么这个关键步骤的成本就降到以前的 1/5 甚至是1/10。”郑文山说。
第二，大规模生产。一般来说，任何工业产品在大规模生产之后成本都会有所下降，通过规模化量产也是降低成本的一种方式。据了解，墨卓生物目前已建成超 4000 平米的办公区、实验室和厂房，其中包括 P2 细胞实验室、PCR 扩增实验室和 800 平米的十万级 GMP 生产车间，为大规模化生产提供保障。
第三，高质量的原材料国产替代。“我们最初的研发阶段所采用的原材料大都以国外进口为主，如今随着国产生物试剂的发展，其性能参数与国外试剂已经不相上下，所以我们也在逐步进行高质量国产原料的替代来实现成本的降低，从而让单细胞测序技术能够惠及更多科研工作者以及终端用户。”郑文山补充说。
“目前，检测单个样品的成本超 1 万元人民币，我们希望在未来几年能够把整体的单细胞测序解决方案成本降到目前的 1/10。”郑文山表示。
除了把整体解决方案的成本降低，墨卓生物现阶段还聚焦多组学和多样本类型进行发力。“单细胞测序领域多组学是一大趋势。大部分厂商都专注于转录组，而我们在转录组的基础上也在开发其他组学，比如表观遗传组、蛋白组等。而针对转录组我们已经推出产品，目前在持续优化中，同时针对全长转录组，以及集中于 5’端跟免疫相关的产品也都会陆续推出。”郑文山介绍道。
“此外，目前大部分高通量单细胞测序仪器和试剂盒都只适用于新鲜样本，我们一方面把高通量单细胞测序技术从真核生物细胞拓展到原核生物细胞；另一方面，也在把单细胞测序产品的应用范围拓展到包括 FFPE 样本等更多类型。”他表示。
谈及墨卓生物中长期发展规划，郑文山表示，“我们主要专注于深耕单细胞测序领域。首先，开发高质量的'中国方案’，在性能和国外产品基本一致的前提下，实现整体解决方案价格的大幅降低；其次，持续发力产品端，实现单细胞测序的多组学覆盖，同时拓展更多样本类型；除此之外，我们还希望从应用端深入挖掘一些未被满足的用户需求，以此来反向开发和优化产品，把单细胞测序技术应用到临床检测、制药开发等领域，解决更多未被满足的临床需求。”
对于公司在发展过程中可能会遇到的挑战，在郑文山看来，“首先，作为一家初创公司，不论从融资层面还是团队成长层面，墨卓生物的发展都较为迅速，所以公司团队管理层面对我们提出了更高的要求；其次，我们深知想要成为一家大型生物技术公司，需要让产品能够惠及全球客户。今年是墨卓生物的商业化元年，现阶段我们主要扎根中国大陆，海外布局才刚刚开始，所以在未来全球化出海布局的过程中我们可能会面临一些新的挑战。当然，这些挑战也是我们在未来需要不断完善和努力的方向。”
宏观产业层面，郑文山指出，高通量单细胞测序技术就好比是“测序领域的显微镜”，传统的整体样本测序得到的是整体平均值，而单细胞测序可以得出精确到单个细胞的信息。“先前很多研究我们关注到的只是整体，而如今借助单细胞测序技术，我们能够把整体中的每一个个体进行观察和分析，这就相当于把研究的逻辑和视角提升到一个崭新的维度。”他补充说。
“更为关键的是，在全球层面，单细胞测序是一个相对比较新兴的技术，这也是中国可能在国际生物技术和应用领域进行弯道超车的一个潜在赛道。”郑文山指出，“中国占据全球大约 1/4-1/5 的市场份额，与此同时，随着国家对新兴技术研发的投入和重视也在逐步增强，国内的市场规模在未来会持续快速增长，这个比例还将会进一步增加。”
“放眼国内，整个单细胞测序产业链其实是很广的，而我们在产业链中所扮演的角色是产品开发和优化。我们立足这个环节中开发出更多高质量、高性价比，能够切实满足用户需求的创新产品，同时，在此基础上，我们与上游的高质量国产原料供应商，与下游的科研服务机构，以及与终端用户（如科研人员、临床医生、药物开发人员等）一起携手合作，共同构建和推进蓬勃发展的单细胞测序产业新生态。”郑文山总结说。
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