基因编辑工具是一种具有变革性的技术手段，可从 DNA 或者 RNA 层面靶向敲除、加入和替换突变基因，从而实现对基因组水平的精确调控。
不过，现阶段，在哺乳动物基因组中靶向整合基因片段的方法存在可编程性低、插入片段尺寸受限、效率低以及特异性不足等问题，这些难题一定程度上限制着基础研究和基因编辑疗法的进一步开发和应用。
近日，来自麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的科学家们改进了基因编辑技术，设计出了一种升级版的先导编辑（prime editing）技术 PASSIGE 的变体——eePASSIGE 系统。这一新方法结合了先导编辑和重组酶，前者可以直接编辑多达 100 或 200 个碱基对，后者可以高效将数千个碱基对的 DNA 片段插入基因组特定位置。在研究中，使用 Bxb1 重组酶变体 eeBxb1 的新系统的整合效率比 PASTE 平均高出了 16 倍。
论文中指出，新系统能够高效在人类细胞基因组中插入或替换完整的基因序列（entire genes），并有望用于治疗遗传性难治疾病。
（来源：Nature Biomedical Engineering）
本研究的通讯作者是博德研究所核心成员、Merkin 医疗变革技术研究所所长兼 Richard Merkin 教授刘如谦，共同第一作者是Xin D. Gao，他在刘如谦实验室从事博士后研究。
“据我们所知这是哺乳动物细胞中可编程靶向基因整合的首批案例之一，能够满足潜在治疗相关性的主要标准。如果可以将在培养的人类细胞中实现的效率转化到临床中，我们预计新方法可以改善和治疗已丧失功能的遗传性疾病。”刘如谦在官方新闻稿中如是说。
升级 PASSIGE 重组酶，整合效率提高 16 倍
长久以来，将大片段 DNA 序列靶向整合到基因组中一直是一个重要的挑战。现有的方法包括 PASSIGE、PASTE、CRISPR 相关转座酶以及核酸酶介导的基因整合，不过，这些方法或多或少都存在效率不高或者不良副产物发生频率高等问题。
“基因编辑领域一直在追求将整个健康基因序列（通常有数千个碱基对）引入基因组的原始位置这一目标。这样，无论患者在致病基因中发生了哪种突变，这种方法都可以潜在治疗许多患者，而且还可以保留周围的 DNA 序列。”
2021 年，刘如谦团队朝着这一目标迈出了关键的一步，该团队在先导编辑技术的基础上开发了一种双重先导编辑技术（twinPE），该方法在基因组中安装重组酶“着陆点”，然后利用 Bxb1 等天然重组酶催化 DNA 片段整合到质粒编辑的基因组特定位点。这些酶以称之为“着陆点”的特定基因组序列为目标，这些序列起到“着陆点”的作用。通过这种方法，将在人类细胞中可编辑的基因长度扩展到了数千对碱基。
（来源：博德研究所官网）
后续，这项技术得以进一步优化并由刘如谦创办的 Prime Medicine 公司商业化，名为基因编辑辅助位点特异性整合酶基因编辑 (prime-editing-assisted site-specific integrationase gene editing，PASSIGE)。虽然 PASSIGE 能够将大片段 DNA 整合到基因组中，但是 PASSIGE 的编辑效率并不高，总体整合效率约为 2.6%–6.8%，且只能在一小部分细胞中整合编辑，可能不足以治疗与功能基因丧失相关的大多数遗传疾病。
在最新的研究中，该团队着重提高 PASSIGE 系统的整合效率，他们发现重组酶 Bxb1 是限制 PASSIGE 效率的“罪魁祸首”，并尝试利用团队此前开发的一种生物分子进化方法 PACE （噬菌体辅助持续进化，phage-assisted continuous evolution）快速进化更高效的 Bxb1 变体，通过进化 Bxb1 获得更高的 PASSIGE 整合效率。
改进后的版本 eePASSIGE 在其前身 PASSIGE 的功能基础上，使用了更高效的重组酶 Bxb1，整个系统结合了先导编辑和筛选的高活性重组酶，可以有效将数千个碱基对大小的 DNA 序列插入基因组中的特定位置。
在数十种活性增强的 Bxb1 变体中，在人类细胞中，一种进化的变体 evoBxb1 与重组酶附着位点整合，其基因组整合效率平均提高了 2.7 倍。然后，该团队结合进化突变筛选出了活性更高的变体 eeBxb1，其在小鼠和人类细胞中可平均整合 30％ 的基因有效载荷，比原始技术 PASSIGE 的载货量多了 4 倍，比另一种定点插入长片段的方法 PASTE 多约 16 倍。PASTE 由麻省理工学院的 Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 团队开发，团队称可以在目标位置插入长达 36,000 个碱基对的序列。
图 | 在不同位置对 PASSIGE、evoPASSIGE、eePASSIGE 和 PASTE 进行表征（来源：上述论文）
接下来，该团队测试了 PASSIGE 将基因载荷整合到 HEK293T 和 N2a 细胞中 8 个治疗相关性内源性基因组位点的能力，evoPASSIGE 和 eePASSIGE 在这 8 个治疗相关性内源性基因组位点的整合效果均显著优于 PASSIGE，而PASSIGE 在所有测试位点的整合均显著优于 PASTE。该团队还通过高通量测序方法 HTS 验证了 ddPCR 量化的整合效率，结果表明进化和工程化的 Bxb1 变体显著提高了重组效率，而不会增加插入/缺失频率。
通过脱靶分析，研究人员指出，为了实现最高的整合效率，同时最大限度减少脱靶事件，建议将 attP 安装到基因组中并使用 eeBxb1 变体作为重组酶。
可用于治疗囊性纤维化等遗传疾病，已在推进治疗应用
为了评估治疗性基因片段的敲入是否可以翻译成蛋白质，该团队评估了 F9 在表达白蛋白的肝细胞衍生的 HuH7 细胞中的整合和表达，EvoPASSIGE 和 eePASSIGE 的 F9 表达量分别比 PASSIGE 高 5.0 倍和 8.7 倍。这些结果表明，evoPASSIGE 和 eePASSIGE 是一种高效且可编程的大片段 DNA 整合技术，能够介导多种治疗相关基因位点的靶向基因整合，其效率适用于多种遗传疾病。
确定了在 HEK293T、N2a 细胞和 HuH7 细胞中的靶向基因整合能力之后，该团队随后评估了新工具在更多种治疗相关细胞类型中的表现，包括原代人类成纤维细胞和人类诱导多能干细胞（iPSC）。
研究团队在原代人成纤维细胞中采用了非质粒递送方法，递送了先导编辑工具、重组酶的 mRNA、合成 pegRNA 以及编码供体序列的整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV）。结果显示，这种递送方式显著提高了整合效率，eePASSIGE 在 COL7A1 和 FANCA 基因座中分别表现出 30% 和 18% 的平均整合率，比 PASSIGE 提高了 14 倍。PASSIGE 和 eePASSIGE 在两个脱靶位点 OT1 和 OT2 上的脱靶整合率分别为 0.008% 和 0.004%。
“总之，这些结果强调了 eePASSIGE 在各种细胞类型中具有稳健靶向基因整合的潜力，同时也表现出能够尽量减少细胞毒性。”
图 | 评估 PASSIGE 变体的治疗潜力（来源：上述论文）
研究人员称，该系统基因编辑的效率比类似方法高出几倍，也对先导编辑的治疗应用具有重要意义。可以想象，它可以用来设计针对囊性纤维化或斯塔加特病等疾病的单一基因疗法。这些疾病通常是由同一基因中数百种不同的突变之一引起的，只需用健康的基因副本替换突变的基因即可。
该论文的通讯作者 Xin D. Gao 也指出，eePASSIGE 的高效性和多功能性令人兴奋，它可能会催生出一种新型的基因组药物。另一方面，我们还希望它能为整个领域的科学家研究基本生物学问题提供一种重要工具。
刘如谦在官方新闻稿中透露，希望该系统成为患者实现靶向基因整合益处的重要一步，且已经开始推进治疗应用。为了实现这一目标，我们正在尝试将 eePASSIGE 与其开发的工程病毒样颗粒等递送系统相结合，以克服限制基因编辑器在体内进行治疗的递送难题。
对于筛选的高活性重组酶，论文中还提到，除了应用于设计 PASSIGE 变体之外，预计还可以用于修饰 DNA，用于合成生物学、以及细胞和基因治疗等等。
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