Nature子刊 | 脑代谢与抑郁改善的桥梁--PDK2

脑代谢与抑郁改善的桥梁，图片来源网络

2023年5月15日山东第一医科大学附属济宁第一人民医院江沛研究团队在Nature子刊molecular psychiatry发表“Targeting PDK2 rescues stress-induced impaired brain energy metabolism”，揭示了皮层PDK2在调节大脑能量代谢和抑郁症发病中发挥重要作用。

抑郁症是一种常伴有能量代谢紊乱的精神疾病，在抑郁症患者中经常观察到下丘脑垂体肾上腺轴反应失调以及糖皮质激素(GC)异常释放。然而，GC与脑能量代谢之间的相关病因仍知之甚少。在这里，作者使用代谢组学分析表明，慢性社交失败压力(CSDS)暴露的小鼠和首发抑郁症患者的三羧酸(TCA)循环受到抑制。线粒体氧化磷酸化减少伴随着TCA循环受损。与此同时，线粒体TCA通量的守门人丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性受到抑制，这与CSDS诱导的神经元丙酮酸脱氢酶激酶2(PDK2)表达相关，从而增强PDH磷酸化。GC在能量代谢中具有公认的作用，于是作者在该研究中进一步证明糖皮质激素受体(GR)通过直接结合其启动子区域来刺激 PDK2表达。同时沉默PDK2消除了糖皮质激素诱导的PDH抑制，恢复了神经元氧化磷酸化，并提高了同位素标记的碳进入TCA循环的通量。在体内，GR或PDK2的药理学抑制和神经元特异性沉默可恢复CSDS诱导的PDH磷酸化，并对慢性应激暴露发挥抗抑郁活性。糖皮质激素信号受损被认为是抑郁症发生的主要原因，高浓度糖皮质激素可抑制大脑葡萄糖利用率。综上所述，该研究结果揭示了抑郁症表现的一种新机制，即升高的GCs水平通过GR调节PDK2转录，从而损害大脑能量代谢并导致这种情况的发生。

图一 CSDS在小鼠中诱导抑郁样行为和首发MDD患者的代谢特征

社会压力是人类抑郁症的主要原因，社交回避、快感缺乏和绝望是抑郁症的核心症状。CSDS模型被广泛用于诱发社交回避和快感缺乏，被认为是最具代表性的抑郁症动物模型。在暴露10 天CSDS之后，进行了一系列评估抑郁样行为的测试。当存在目标鼠时，没有CSDS的鼠会在交互区花费更多的时间。然而，被打败的小鼠往往会呆在角落里以避免攻击者，并且花更少的时间与目标鼠进行社交互动。社会互动比率(SI)是根据有或没有目标小鼠存在的相互作用区时间的持续时间计算的，随机选择12只易感小鼠(SI < 1)作为CSDS组，并选择相同数量的未接受CSDS的小鼠作为对照组。与对照小鼠相比，易感小鼠在暴露于压力后的强迫游泳试验（FST）中表现出不动时间显著增加，同时在糖水偏好试验（SPT）中对糖水的偏好降低。在高架十字迷宫(EPM)测试中，CSDS组的小鼠开放臂的时间明显减少，进入开放臂次数减少。皮质在调节压力诱发的行为障碍（包括MDD）中起着关键作用。作者通过代谢组学分析确定了小鼠额叶皮层和血清以及首发MDD患者血清中潜在差异表达的代谢物。正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)显示对照组和CSDS小鼠之间的分离。此外，作者还进行了200次随机排列测试，R2和Q2值证实了后续优化分析的适当性。在排列检验中，R2和Q2分数表示模型的拟合优度和预测能力。基于两个标准（VIP > 1和P值< 0.05），在皮质和血清中鉴定出差异丰富的代谢物，结果发现与TCA循环相关的代谢物水平下降。在CSDS模型小鼠和患者中，TCA循环途径中的代谢物富集，这意味着TCA循环受到明显损害。

图二 慢性应激引起能量代谢障碍

为了表征CSDS小鼠脑代谢的变化，作者进一步检测了不同脑区中与葡萄糖氧化相关的几种底物的含量。CSDS小鼠皮质中的乙酰辅酶 A、柠檬酸和ATP水平低于对照组小鼠。皮质慢性应激后小鼠表现出抑郁样行为障碍，这些小鼠皮层脑区乙酰辅酶A、柠檬酸和ATP水平降低，海马脑区柠檬酸和ATP水平，此外TCA循环路径相关的代谢产物富集，这些结果表明存在能量代谢障碍。分子实验表明应激后小鼠皮层和海马脑区PDH活性降低，然而PDK的亚型PDK2 mRNA和蛋白水平升高，抑郁症患者外周血液中PDK2 mRNA水平升高。免疫荧光实验发现PDK2表达在神经元和星形胶质细胞上，在小胶质细胞上几乎不表达。更进一步来说，慢性应激促进神经元PDK2表达。免疫荧光染色结果进一步显示PDK2主要在神经元和星形胶质细胞中表达，在小胶质细胞中的表达较少。体外研究结果还表明，PDK2在神经元和星形胶质细胞中均高度表达。然而，CSDS暴露更明显地诱导神经元PDK2表达，并且更容易诱导星形胶质细胞中的 PDK2。作者还比较了首发MDD患者和健康对照者外周血单个核细胞中PDK2的mRNA水平，抑郁症患者的PDK2 mRNA水平高于健康对照组，并且与汉密尔顿抑郁量表得分呈正相关。

图三 GR通过与其结合来调节PDK2基因的表达

GC是能量代谢和应激反应的重要调节因子，MDD患者和CSDS小鼠的血清皮质醇和皮质酮(CORT)含量分别明显增加。作者进一步评估了CORT对神经元凋亡和GR转运的影响。结果表明，CORT处理显著增加了切割的caspase-3的表达。CORT 处理的神经元诱导GR表达增加并导致GR易位至细胞核，而米非司酮(RU486)预处理阻止CORT诱导GR表达和GR易位至细胞核。接下来在体外检测了不同时间点CORT暴露对神经元中PDK表达和PDH活性的影响。qRT-PCR结果显示PDK2表达在CORT暴露12小时后明显增加，并在24小时达到峰值，而在任何时间点均未检测到 PDK1、PDK3 或 PDK4 表达的差异。与qRT-PCR的结果一致，免疫荧光染色显示PDK2的水平在12和24小时增加。PDH 活性被高水平的PDK2 mRNA抑制，类似地，CORT暴露后原代皮层神经元的 PDK2蛋白水平和p-PDH/PDH比率均增加。这些数据表明CORT暴露导致 PDK2 表达增加和 PDH 活性抑制。GC通过激活GR来调节基因转录，然后GR与靶基因启动子区域的GRE结合。还发现pGL3-P1（-2000至0 bp）和pGL3-P3（-1000至0 bp）表现出高水平的荧光素酶表达，而 pGL3-P2（-2000至-1000 bp）不影响荧光素酶活性。这表明-1000和0 bp之间的PDK2启动子区域对其在CORT处理中的表达至关重要。构建GR表达质粒验证GR在PDK2启动子活性调控中的作用，发现表达pCDNA3.1-GR的神经元比不表达pCDNA3.1-GR的神经元表现出更高的荧光素酶活性，且这种效应取决于GR浓度，GR过表达增强了PDK2 mRNA水平。使用GR靶向siRNA监测PDK2启动子活性并通过蛋白质印迹分析评估RNA干扰的效率表明PDK2 启动子活性和PDK2表达显著降低。利用ChIP测定GR是否与PDK2启动子相互作用，ChIP信号在CORT处理中得到增强，并因GR沉默而减弱。总之，这些发现表明GR与PDK2启动子结合并调节神经元中的PDK2表达。

图四 沉默PDK2调节耗氧率并改善CORT引起的TCA循环碳通量干扰

为了评估响应PDK2敲低的线粒体功能，测量了神经元的OCR（反映细胞呼吸能力）。与对照组相比，CORT治疗导致线粒体呼吸能力显著降低；然而，这些影响因PDK2耗尽而减弱。在PDK2沉默后将碳通量追踪到TCA循环中间体中，¹³C标记的葡萄糖可通过糖酵解代谢为M+1和M+3丙酮酸。M+1和M+3丙酮酸均进入线粒体，被PDH转化为M+1和M+2乙酰辅酶A，然后进入TCA循环。柠檬酸盐（从 M+1到 M+6）、α-酮戊二酸盐（从M+1到M+5）、富马酸盐（从M+1到M+4）和苹果酸盐（从M+1至M+4) 在CORT存在的情况下下降，而PDK2沉默显著缓解了这种下降。CORT 处理后总¹³C富集明显降低，然而，在PDK2敲低的情况下观察到相反的情况。这些结果表明，暴露于CORT会抑制从糖酵解途径进入TCA 循环的碳通量，从而导致神经元功能所需的能量供应不足。相反，PDK2耗竭对进入TCA循环的葡萄糖流量具有明显促进作用。

图五 PDK抑制减弱CSDS诱导的抑郁行为

二氯乙酸(DCA)是一种 PDK 抑制剂，可抑制PDH磷酸化并促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A。为了评估GR-PDK2-PDH轴是否影响CSDS小鼠的行为，CSDS小鼠每天一次注射RU486（20 mg/kg/天）或DCA（100 mg/kg/天）。结果发现每天注射RU486或DCA不仅显著改善了SI比率，而且增加了抗压小鼠的数量。RU486或DCA还缓解了SPT、FST和EPM中CSDS诱导的抑郁样行为。此外，CSDS增加了PDK2和p-PDH水平，使用RU486或 DCA治疗可明显逆转这些影响。作者还发现DCA或RU486增加了PDH活性，柠檬酸含量、ATP水平和NADH/NAD+比率。为了进一步证实DCA的神经保护作用，作者检测了皮质神经元中发生的潜在形态学改变。HE和Nissl 染色结果表明，RU486或 DCA处理的神经元的形态异常得到改善。HE染色显示对照组细胞形态正常，而CSDS组细胞形态异常，细胞核固缩，排列紊乱。Nissl 染色还显示CSDS组尼氏体减少，并伴有肿胀、细胞紊乱和膜丢失。用RU486或DCA处理后，细胞形态恢复，尼氏体数量显著增加。CSDS组皮质神经元凋亡细胞数量明显高于对照组，这种效果被RU486或DCA治疗逆转。

图六 糖皮质激素调节PDK2表达，损害大脑能量代谢

为了研究GR或PDK2对PDH活性的作用，将选定的GR或PDK2 shRNA序列嵌入到miR30骨架中。将AAV-sh-NC、AAV-sh-GR或AAV-sh-PDK2注射到额叶皮层，三周后小鼠接受10天的CSDS。免疫荧光染色结果显示EGFP和βIII微管蛋白阳性细胞共定位，注射病毒的皮质中GR或PDK2表达大大降低。慢性应激出现抑郁样行为的小鼠连续接受10天腹腔注射糖皮质激素受体拮抗剂或PDK抑制剂后可明显改善社交障碍、减少在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。上述糖皮质激素受体拮抗剂或PDK抑制剂可明显阻断慢性应激引起的PDK2水平升高，并能增加ATP水平、PDH活性。通过病毒特异性敲除皮层神经元GR可降低PDK2水平，在敲低PDK2后可显著减少PDH的磷酸化水平，增强PDH活性，这种敲低并不会影响小鼠抑郁样行为。但慢性应激小鼠在接受上述敲低后可明显改善抑郁样行为障碍。

综上所述，本文发现了GR通过直接与其启动子区域结合并通过调节神经元TCA通量和ATP产生来激活PDK2的转录，这可能在维持脑能量稳态中发挥重要作用。此外，抑制PDK2表达可改善CSDS诱导的行为缺陷和脑损伤。慢性应激可抑制皮层三羧酸循环，减弱线粒体氧化能力，引起抑郁样行为，通过敲低PDK2或糖皮质激素受体后均能改善抑郁样行为障碍。该研究确定了抑郁症发病机制的新机制，并为治疗这种疾病提供了潜在的治疗靶点。

文章来源

https://www.nature.com/articles/s41380-023-02098-9