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2023年7月14日意大利Paolo Calabresi团队在Science Advance发表研究论文“Intensive exercise ameliorates motor and cognitive symptoms in experimental Parkinson’s disease restoring striatal synaptic plasticity”，揭示了一种优化的Nurr1激动剂在帕金森病模型中提供了缓解运动功能障碍作用。
核受体Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育和维持都至关重要，它是帕金森病的一个很有前途的分子靶点。作者之前鉴定了三种Nurr1激动剂，它们具有相同的化学支架，4-氨基-7-氯喹啉。该研究中多种化合物增强了Nurr1的转录活性，从而鉴定出一种优化的脑渗透激动剂4A7C-301，该激动剂在体外显示出强大的神经保护作用。此外，4A7C-301在MPTP诱导的雄性PD小鼠模型中保护中脑多巴胺神经元，改善运动和非运动嗅觉缺陷，且无运动障碍样行为。此外，4A7C-301显著改善AAV2介导的α-突触核蛋白过表达雄性小鼠模型中的神经病理学异常并改善运动和嗅觉功能障碍。4A7C-301的这些疾病情绪化特性可能值得临床评价该或类似化合物用于PD患者的临床治疗。
图一 鉴定4A7C-301作为Nurr1激活的优化激动剂
此前，研究小组设计并合成了抗恶性疟原虫活性的强效抗疟疾杂交体。作者推测，如果4A7C是有效的SAR，这些4A7C衍生物会激活Nurr1的转录功能。使用建立的Nurr1报告基因分析，发现这些衍生物中20%的衍生物表现出可检测到的Nurr1功能的激活。4A7C-101是第一个激活Nurr1的先导化合物，其EC50值低于氯喹（CQ），并被选择进行进一步优化以评估4A7C-101的三个主要修饰位点的结构修饰的影响。虽然这些衍生物表现出良好的Nurr1活性和显著低的EC50值作为进一步研究的临床前候选物。通过分析SD大鼠口服后不同时间点的血浆和脑匀浆，结果表明4A7C-301能很好入脑，且以剂量依赖的方式增加了Nurr1-LBD和全长Nurr1的转录活性，其效力高于CQ。综上所述，这些数据表明CQ/4A7C-301选择性地激活了Nurr1的转录活性。总之，这些定点突变分析表明，不同的Nurr1激动剂特异性地激活Nurr1的转录功能。
图二 通过Nurr1体外比较CQ和4A7C-301的神经保护功能
作者接下来评估CQ和4A7C-301是否能诱导神经保护作用，发现CQ和4A7C-301均以剂量依赖的方式显著降低了MPP+诱导的细胞毒性，4A7C-301在N27-A和MN9D细胞中的效率比CQ低20倍。为了证实CQ/4A7C-301的这些神经保护作用是Nurr1依赖的，在N27-A和MN9D细胞中检测了Nurr1过表达或敲除条件下对MPP+（1-甲基-4 -苯基 -吡啶离子MPP+，是 MPTP 的活性代谢物）的细胞活力和细胞毒性。与对照组相比，Nurr1过表达增强了CQ和4A7C-301对MPP+的神经保护作用。相比之下，Nurr1敲低不仅在没有MPP+的情况下显著降低了细胞活力，而且还完全消除了CQ和4A7C-301在N27-A和MN9D细胞中对MPP+的神经保护作用，这表明CQ和4A7C-301的神经保护是通过Nurr1激活发生的。接下来，作者研究了线粒体功能障碍和/或氧化应激是否与细胞活力有关。4A7C-301在500 nM时最佳地抑制了小胶质细胞对LPS的激活，比CQ低40倍。以上结果表明，4A7C-301抑制神经炎症。
图三 CQ抑制自噬，但4A7C-301保护自噬
已知CQ通过在自噬过程的后期破坏成熟的自噬体-溶酶体（APL）融合形成自噬溶酶体来抑制自噬。由于自噬失调与PD病理有关，作者探究4A7C-301是否也影响自噬。与EBSS对照条件相比，用有效的溶酶体质子泵抑制剂巴菲霉素A1孵育完全抑制了自噬的最后一步。CQ处理显著抑制了APL的形成，4A7C- 301处理并没有抑制APL的形成。由于CQ会影响溶酶体酸度，检测了其对溶酶体pH的影响。BafA1和CQ显著增加了HeLa的溶酶体pH，而不是4A7c-3-301，提供了它们对自噬差异作用的可能机制。进一步分析了HeLa细胞中阶段特异性自噬标记物的自噬通量。LC3B-II和p62的表达变化显示，在BafA1和CQ的存在下，自噬被启动，但没有终止。相反，自噬在4A7C-301的存在下完成，p62水平下降。自噬在4A7C-301存在的情况下进行，而BafA1或CQ则没有自噬。当给予MPP+时，自噬被破坏，如LC3B-II积累和晚期的p62水平一致。在N27-A细胞中，4A7C-301处理显著恢复了自噬，导致p62成功降解。
图四 CQ和4A7C-301对MPTP诱导的雄性小鼠的神经保护作用
4A7C-301可能在PD动物模型中表现出强大的疾病修饰作用。作者使用了基于神经毒素和遗传因子两个小鼠模型。首先，使用亚慢性MPTP诱导的雄性小鼠模型，连续给予CQ、4A7C-301或左多巴16天。与对照组相比，MPTP治疗的小鼠运动功能受损，尽管使用了CQ和L-301的浓度的十分之一左右，但三种药物均显著挽救。由于嗅觉功能障碍是PD47中常见的前驱症状，作者研究了这些化合物是否可以改善这种非运动功能障碍。在嗅觉辨别测试中，MPTP损伤小鼠在区分熟悉和不熟悉气味方面存在障碍，给予CQ和4A7C-301均显著恢复了嗅觉，而L-DOPA则没有恢复。接下来，每隔一天或第三天检查一次异常的不自主运动评分，包括轴向、肢体和口腔语言运动障碍，以监测运动障碍样行为。L-DOPA治疗在注射后7天开始就引发了严重的异常不随意运动（AIMs）。
相比之下，用CQ或4A7C-301治疗没有诱导任何可检测到的AIMs。作者还检测了是否有神经炎症以Iba-1作为活化的小胶质细胞标记物。MPTP处理显著增加了STR和SN中的Iba-1+小胶质细胞。用CQ和4A7C-301治疗显著降低了这两个区域的Iba-1+小胶质细胞。4A7C-301处理显著恢复了SN和STR的DA水平，而CQ仅在SN的DA水平。最后，在第14-15天重复了这些慢性阶段的行为测试，在嗅觉和AIMs测试中观察到类似的行为模式。然而，只有旋转体运动缺陷仍然存在，而圆柱体测试缺陷消失，表明一定程度的自发恢复。以上结果表明，MPTP损伤小鼠模型表明，4A7C-301改善了运动和非运动缺陷，减少了神经炎症，并且没有任何运动障碍样的副作用。然而，MPTP损伤作为PD模型有一定的局限性，包括一定程度的自发恢复。因此，接下来使用了基于aav2-αSyn的小鼠模型，该模型更好模拟了与人类PD发病机制相关的进行性和病理生理学特征。
图五 4A7C-301对αSynWT和αSynA53T诱导的雄性小鼠模型表现出强较的神经保护作用
作者将表达野生型或突变型αSyn的腺相关病毒注射到雄性小鼠的SN中。分别给予CQ或4A7C-301。从术后第4周至第8周。从术后第6周开始，小鼠出现在圆柱体的运动缺陷，αSynA53T诱导小鼠的严重程度更高。在所有试验中，A7C-301治疗改善了αSynWT和αSynA53T诱导小鼠的运动缺陷。在嗅觉辨别试验中，αSynWT-和αSynA53T诱导的小鼠从术后第4周开始就表现出嗅觉功能障碍。CQ和4A7C-301治疗均挽救了术后6周和8周αSynWT-小鼠的嗅觉功能障碍。然而，只有4A7C-301显著逆转了αSynA53T-小鼠的嗅觉功能障碍，而两组间在速度/迁移率方面没有显著差异。在行为测试之后处死小鼠并通过免疫组化分析来确定治疗对其大脑的影响。CQ和4A7C-301处理分别部分抑制了αSynWT-小鼠SN和STR中TH+和NeuN+神经元和TH+纤维的丢失。然而，只有4A7C-301处理显著阻止了αSynA53T-小鼠中TH+和NeuN+神经元和纤维的丢失。只有4A7C-301增加了αSynA53T-小鼠中的DA水平。以上结果表明4A7C-301有效缓解了这些动物模型的致病表型，其效力大于CQ。
该研究指出4A7C-301也有其局限性。例如，4A7C-301调控Nurr1的转录功能和/或表达的作用模式尚不清楚。因为Nurr1在不同的细胞环境中既可以作为转录激活因子，也可以作为抑制因子，而4A7C-301同时影响这两种功能。此外，在评估其治疗潜力时，还需要充分解决4A7C-301的潜在脱靶效应和毒性。虽然还需要进一步的研究，但Nurr1是开发神经保护治疗药物的一个有前途的靶点。优化其靶向激动剂，如4A7C-301或其类似化合物，可能具有作为散发性和家族性帕金森病的机械性、疾病修饰治疗的潜力。
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh1403
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