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2023年8月8日，匹兹堡大学环境与职业健康系Radosveta Koldamova团队在International Journal of Molecular Sciences上发表“Extracellular Vesicles in Young Serum Contribute to the Restoration of Age-Related Brain Transcriptomes and Cognition in Old Mice”，揭示了年轻血清中的细胞外囊泡有助于恢复老年小鼠与年龄相关的脑转录组和认知能力。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，广泛地存在于各种体液和细胞上清中，并稳定携带了一些重要的信号分子。作者之前研究表明循环细胞外囊泡（EVs）对年轻血清对骨骼肌再生级联至关重要。作者发现注射年轻血清显著改善了与年龄相关的记忆缺陷，并且这些影响在血清EVs消耗后被消除。对脉络膜丛的RNA-seq分析表明，EVs介导的对参与屏障功能和跨屏障转运的基因的影响。在年轻的血清治疗后，海马转录组分析显示出抗衰老基因Klotho的显著上调，并在EVs消耗后效果消失。Klotho敲除和杂合子小鼠的转录组学分析显示，与转运、胞吐和脂质转运相关的基因下调，而上调的基因与激活的小胶质细胞相关。作者的研究结果表明，EVs作为载体从外周向大脑传递信号的意义，以及Klotho在维持大脑稳态中的重要性。
图一 年轻血清对老年小鼠认知能力的有益影响依赖于细胞外循环
来自异慢性异种共生研究、血液交换和血浆转移模型证据表明，年轻血液中的循环因子可以使老年小鼠的多个器官恢复活力，包括大脑。然而，相关的因素仍然不明确。在血浆转移实验中，老年小鼠系统地处理年轻小鼠的血浆，表明老年小鼠海马依赖的学习和记忆得到改善。作者假设年轻血清中的EVs携带促进前年轻表型的因子。作者使用先前描述的实验范式，即老年小鼠在行为测试开始前接受尾静脉注射年轻血清、年轻血清耗尽或生理盐水三周，在这两种行为测试中，与相应的老年假手术对照组相比，老年小鼠的年轻血清治疗显著改善了认知表现。相比之下，当年轻血清中的EVs耗尽时，年轻血清对老年小鼠认知能力的影响被消除，小鼠在新物体识别和恐惧条件反射方面表现出与对照组相当的表现。在年轻血清中循环的EVs对老年小鼠认知功能的恢复至关重要。
图二 对小鼠血清EVs的综合分析确定了与年龄相关的脂质谱变化
之前，作者已经证明了来自年轻动物的血清EVs恢复了老年小鼠的骨骼肌生物能学和再生潜力。在本研究中，进一步描述了血清EVs中与年龄相关的变化，这些变化可能会影响其信号传导潜能和靶细胞反应。脂质是EVs的重要分子组成部分，作为生物活性分子，脂质介质的载体，以及与受体细胞的影响结合。多项研究已经证明，EVs的脂质组谱和脂质组成与母体细胞相比有很大的差异。为了评估与衰老相关的血清EVs中脂质含量的变化，作者检测了9种主要脂质类及其分子种类。首先从幼龄小鼠和老龄小鼠的血清中分离并进行鉴定，结果表明，年轻的EVs比从旧血清中分离出的EVs具有更高的磷脂含量。
图三 年轻血清治疗对老年脉络膜丛基因表达的特异性影响
转录组分析发现大量的显著上调基因和较少的下调基因。与注射年轻血清和假手术的小鼠相比，下调的基因明显多于上调的基因，这表明从年轻血清中去除EV后剩余的物质对基因表达具有更大的抑制作用。使用这337个常见上调的基因进行的GO分析显示，在使用年轻血清处理的小鼠中，与细胞粘附、离子和跨膜转运、神经系统发育和细胞迁移相关的顶级生物过程均上调。在细胞粘附GO项的前20个基因中，观察到许多基因的表达增加，这些基因对维持脉络膜丛的血-脑脊液屏障的完整性很重要。这些上调的基因包括Pcdh1，它编码钙粘蛋白超家族的一个成员，并在脉络膜丛上皮细胞中高表达。Pcdh1功能的丧失导致屏障完整性降低，屏障泄漏增加。这些钙粘蛋白的细胞质尾部形成多蛋白钙粘蛋白-连环蛋白复合物。这些是粘附连接的主要结构单位，在脉络膜丛的运输中很重要。此外，在年轻血清处理后，编码粘附分子的基因的数量显著增加，这些基因在神经元迁移、轴突生长和突触发生中起着重要作用。25天的年轻血清治疗显著影响了老年脉络膜丛的转录谱。一些基因的表达增加，这些基因可以显示更年轻的表型，并恢复脉络膜丛的许多功能，包括屏障的建立、脑脊液的调节和维持神经稳态。这些影响在很大程度上取决于年轻血清中EVs的存在。
图四 年轻血清处理小鼠老年海马中独特的基因表达变化
基于年轻血清作为一种位于血-脑脊液界面的独特屏障，作者推测其外周治疗对脉络膜丛的影响较大。在YS治疗后，Klotho的表达显著上调，而在注射YDS后，这种效应就消失了。随着年龄的增长，大脑中Kl mRNA和蛋白的表达显著减少，并与小胶质细胞激活和炎症小体激活的增加相关。衰老也与EVs中Kl mRNA含量的丢失有关，且膜转运体的表达增加，包括：Abca4，通过磷脂酰乙醇胺脂质物种的转运参与脂质稳态；以及Slc39a4，它编码锌/铁调节转运蛋白。与YS治疗相关的海马中DEG下调，包括编码神经肽加压素、速激肽2和-突触核蛋白的基因。Abca4和Slc39a4表达基因编码的基本蛋白质参与跨膜运输。
图五 Klotho缺失对海马体基因表达的影响
为了研究并进一步揭示α-Klotho对海马转录组的影响，基因本体论分析显示，与翻译、线粒体电子传递和氧化应激反应相关均表达上调。上述类别中的许多差异调控基因编码的蛋白质对外泌体和外泌体的产生至关重要，因此，可能对外周信号到中枢神经系统的外周信号的产生和转移产生重大影响。最近的研究发现，一个名为“疾病相关小胶质细胞”的小胶质细胞子集在AD患者和其他神经退行性疾病的损伤部位积累。DAM基因的特征是参与溶酶体、吞噬和脂质代谢途径的基因的上调，包括被称为AD危险因素的基因，如APOE、TREM2和TYROBP。随着神经退行性变的进展，DAM基因表达上调，这与所谓的“稳态小胶质细胞”基因的显著下调相一致，如P2ry12、P2ry13、Cx3cr1、CD33和Tmem119。发现大约30%的DAM基因在kl缺陷小鼠中显著上调。其中包括Apoe、Trem2、Tyrobp、Axl、Cd68和Cd74，以及许多MHCII类基因。这些基因的变异已被GWAS研究确定与晚发性AD 的风险相关。作者还发现了146个同源基因的互补减少，如Picalm、Adam10和Sort1。在APP转基因小鼠中经常发现的同源基因和DAM基因的上调和下调水平是不同的与淀粉样蛋白沉积相关，这表明kl缺陷小鼠的神经退行性过程与AD小鼠模型相比有所不同。
该研究表明老年小鼠输注YS可以改善其认知能力，并且这种效果很大程度上取决于血清 EV。这些特征突出了它们在细胞间通讯中的重要性。虽然该研究的方法不允许进行囊泡追踪、内化或评估特定细胞类型的反应，即认知能力提高的根本原因是神经元基因表达的变化。需要更多的研究来确定健康个体的溶媒对照是否存在性别差异，特别是与健康老龄化相关的差异。并有望在衰老和神经退行性变的研究中具有治疗意义。
https://doi.org/10.3390/ijms241612550
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