Cell：科学家揭示动物“喜新厌旧”的神经环路机制

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2023年9月14日西班牙CSIC-UMH神经科学研究所Fe´ lix Leroy团队在Cell发表 “Corticotropin-releasing hormone signaling from prefrontal cortex to lateral septum suppresses interaction with familiar mice”，揭示了从前额叶皮质到外侧隔核的促肾上腺皮质激素释放激素信号抑制了与熟悉的小鼠的相互作用。

成年啮齿类动物更喜欢与新的同种动物互动，而不是熟悉的动物，但这种社会偏好（SNP）是来自促进与新个体互动的神经回路，还是抑制与熟悉个体的互动仍不清楚。外侧隔核（lateral septum，LS）是调节情感行为的中枢，且LS中的神经元以GABA能神经元为主。内侧前额叶皮层（mPFC）的腹侧即边缘下区（ILA），主要参与决策并对社会刺激作出反应，也是SNP的必要条件。作者鉴定了小鼠前额叶皮层边缘下区的神经元，它们表达神经肽促肾上腺皮质激素释放激素，并投射到外侧隔核的背侧区域。该研究展示了在熟悉的接触中，CRH调节几个过程，包括稳态和变稳态神经内分泌机制，记忆和非压力环境下的社会行为。CRH的释放如何去抑制rLS神经元，从而抑制与熟悉的小鼠的社会互动，并促进社交新奇偏好。作者进一步证明了ILA后的前2周ILA中CRH表达的成熟如何使发育从对幼鼠同窝小鼠的偏好转变为对新小鼠的偏好。

图一 ILA^CRH神经元投射到背侧LS

作者在ILA中的CRH-Cre小鼠注射一种cre依赖的腺相关病毒，表达膜性GFP和mRuby标记的突触素，以便示踪轴突和突触末端。在LS的背侧区域观察到GFP+纤维，该区域存在mruby标记的轴突末端。此外，将病毒注射到mPFC的其他区域像前边缘区或前扣带区都没有观察到投射到rdLS中的纤维。接下来作者运用逆行标记物CtB-488观察CRH阳性（CRH⁺）神经元，逆行标记的ILA神经元主要位于第2/3层。部分CtB+神经元共表达tdTomato，主要分布于ILA的第2/3层，表明CRH⁺神经元从ILA的第2/3层投射到rdLS上。通过运用神经元标记物发现主要为GABA能。电生理记录表明，当神经元保持+为10mV时，蓝光刺激会引起巨大的向外电流，应用SR95531和CGP55845后消除了蓝光诱导的IPSC。这些结果表明，投射到rdLS上的ILA^CRH神经元是在rLS中产生功能性突触的GABA能神经元的一个亚群。

图二 ILA^CRH神经元抑制与熟悉小鼠的社会互动，并促进社会新奇性偏好

接下来，作者使用化学遗传学方法来调节ILA^CRH神经元的活性，并探测其行为功能。作者首先运用一系列行为学实验验证ILA^CRH神经元是功能不同的神经元，在运动、焦虑或进食相关行为方面没有显著的功能。接下来，测试ILA^CRH神经元是否调节SNP。在唤起过程中，与熟悉的小鼠相比，三个对照组与新小鼠表现出更高的互动时间，这表现为对新小鼠的积极辨别指数偏好。然而，在ILA^CRH神经元被静默的实验组中，受试者小鼠探索新的和熟悉的小鼠上花费时间相同。在学习或回忆过程中，各组小鼠的总探索时间相似，这表明ILA^CRH神经元沉默并不影响探索的动机。因此，在重复的社会互动测试中测试了ILA^CRH神经元的作用，其中一只性别和年龄匹配的新小鼠被呈现给测试小鼠四次。这个测试提供了观察社会互动进化的优势，一只新小鼠逐渐变得熟悉，对照组小鼠随着重复呈现小鼠的交互作用时间逐渐减少。当一只新小鼠在最后的试验中出现时，互动时间回到了它的初始水平，这表明减少不是由于失去了对任务的投入。相比之下，ILA^CRH静默的小鼠在重复呈现过程中交互时间没有减少，这表明ILA^CRH神经元是社会熟悉是必要的。接下来，作者探究过度激活的ILA^CRH神经元是否可以促进社会熟悉化，发现增加ILA^CRH神经元的活性略微促进了社会交互作用的减少，表明ILA^CRH神经元可以双向调节与熟悉小鼠的相互作用时间。综上所述，这些实验表明，ILA^CRH神经元抑制了与熟悉小鼠的社会互动。

图三 ILA^CRH神经元在与熟悉的小鼠互动时会优先反应

如果ILA^CRH神经元调节与熟悉的小鼠的社会互动，可以预期当小鼠与熟悉的小鼠相互作用时，这些神经元会比与新的小鼠相互作用时更活跃。为了验证这一预测，作者对ILA^CRH神经元群进行测定。当记录钙活性时，被试小鼠分别接触新的然后是熟悉的小鼠。首先，作者发现熟悉的小鼠出现引起了测试小鼠钙反应的大幅增加，而新小鼠的出现则引起了小幅度的减少。与接触新小鼠相比，接触熟悉小鼠时的产生的神经元活动峰值更高，但没有看到发生频率的差异。颠倒两只小鼠出现的顺序，得到了相同的结果。这些结果表明，与新接触小鼠相比，ILA^CRH神经元的活动在熟悉的小鼠接触中增加。为了确认ILA^CRH神经元的活性在新的和熟悉的小鼠呈现过程中是否存在差异，光纤记录发现ILA^CRH神经元群体可以编码社会熟悉度。新奇的和熟悉的物体相比，没有看到是神经元活动的变化。作为进一步检测神经元活性，测量了即早报告基因c-fos的表达，测试小鼠与新小鼠的互动比熟悉的小鼠更多。与接触新小鼠相比，第2/3层的ILA^CRH神经元在遇到熟悉的小鼠后表现出更高的c-fos表达，第2/3层ILA^CRH神经元的激活与社会互动的数量呈负相关。总的来说，ILA^CRH神经元群在与熟悉的小鼠进行社会交互时比与新的小鼠更活跃。

图四 rdLS中ILA释放的CRH抑制了与熟悉小鼠的社会互动，并促进社交新奇性偏好

接下来作者将CRH水平降低来进一步探究ILA^CRH神经元如何抑制与熟悉的小鼠的社会互动，ILA^CRH神经元投射到表达CRHR1并调节社交互动以及CRH从ILA释放到rLS是否对社交熟悉是必要的。然后，作者对小鼠进行了SNP行为检测，在唤醒测试中，敲除CRH的小鼠在唤醒试验中没有表现出任何偏好，该组的DI为零。然后进一步探究在rLS神经元中从ILA^CRH释放CRH是否介导熟悉和社交互动偏好行为。首先，研究确定LS中CRH的释放优先发生在熟悉的社会互动中，作者随机呈现新的和熟悉的小鼠，同时记录CRH活动。与接触新的小鼠相比，接触熟悉的小鼠诱导的反应幅度更大，发生的频率没有任何变化。基于Z评分峰值振幅的DI显示了对熟悉小鼠的反应的显著偏好。证明在与新的社会互动相比，rLS中CRH释放在熟悉的社会互动中的更高。这些实验表明，在社会接触过程中，rdLS中ILA^CRH神经元释放CRH抑制了与熟悉小鼠的社会互动，从而促进社会新奇性偏好。

图五 rdLS中的CRHR1+神经元被社会熟悉度激活，调节SNP和熟悉度

由于CRHR1调节社会互动和SNP，作者观察了它是否在LS的ILACRH神经元末端附近表达。将CRHR1-Cre小鼠注射了表达GFP的Cre依赖的AAV，并标记了rdLS中的几个神经元，即ILA^CRH神经元末端靶向的相同区域。膜片钳记录表明rdLS中CRH的释放可使CRHR1+神经元去极化。然后，将WT小鼠植入rdLS套管，并注入CRHR1拮抗剂安他拉明，然后进行SNP行为测试。注入溶媒对照DMSO的小鼠对新的小鼠表现出正常的偏好，而注入安他拉明的小鼠没有表现出新奇的偏好。接下来，对rdLS中的CRHR1+神经元进行了化学沉默，然后测试了小鼠的SNP，与对照组相比，测试组的DI与0没有什么差异。这些实验表明，rdLS中CRHR1受体的激活对于熟悉和SNP是必要的。然后，作者检测了rdLS中的CRHR1+神经元在熟悉的接触中是否比新的接触中优先激活，并标记c-fos。熟悉相互作用中rdLS CRHR1神经元表达c-fos的百分比是新相互作用时的3倍。

图六 来自ILA的CRH信号和熟悉的社会互动去抑制rdLS

为了探究CRHR1激活在rLS中的作用，作者从WT小鼠中制备了急性LS切片，并记录了自发抑制性突触后电流，IPSC的振幅表现出了下降的趋势。接下来进行rdLS神经元的全神经元记录，光刺激导致sIPSC频率、振幅和电荷的下降，在强直性光刺激后，IPSC的振幅也降低。安他拉明的应用阻断了频率、振幅、电荷和电刺激的减少，从而阻断了去抑制效应。综上所述， ILA释放CRH可以抑制rLS神经元。作者接下俩探究在与熟悉的小鼠的社会互动中，rLS是否被去抑制以及这种去抑制的效果是什么，于是记录了rLS神经元群体的钙活性。结果表明，与新的小鼠相遇相比，rLS神经元群体活动在与熟悉的小鼠相遇中会优先被激活。与L2/3 ILA^CRH神经元相似，rLS神经元的激活倾向于与社会互动的数量呈负相关。第2/3层ILA^CRH神经元的激活与rdLS的激活显示出很强的正相关关系，表明一个群体可能控制另一个群体。

图七 ILA中CRH表达的增加支持了年轻小鼠的社会偏好的转变

与成年动物相比，年轻的啮齿类动物更喜欢与它们熟悉同窝小鼠互动。作者通过让年轻的WT小鼠选择每天与它们熟悉的同窝小鼠或不熟悉的小鼠从P7到P21进行互动，来测试小鼠的社会偏好的变化何时发生。在P7和P15之间，小鼠更倾向于与它们的同窝小鼠互动，而社会偏好强烈倾向于熟悉度。然后，社会偏好逐渐转向新的小鼠，在P16之后，对新的小鼠有明显的偏好。PFC和LS都被证明可以控制SNP，而且LS也与幼龄大鼠对自己亲缘关系的偏好相关。然后，作者探究ILA神经元何时开始表达CRH，以及上述ILA到rdLS回路的出现是否有助于社交偏好的改变。观察到ILA^CRH神经元的密度从P7到P21的显著增加。其他前额叶区域相比，在ILA中最强。在ILA内，CRH+神经元的增加主要来自于位于第2/3层的CRH+神经元的增加，接下来作者探讨了ILACRH神经元向LS回路的成熟是否导致了社会偏好的转移。在ILA中缺乏Crh的测试组继续表现出熟悉的偏好，直到P21。这些实验表明，在出生后的第二周和第三周，ILA中CRH表达的增加是导致社会偏好发生变化的原因。

该研究揭示了ILA^CRH 神经元对与熟悉的小鼠的社交互动做出反应，并将CRH释放到rLS 中，以便通过LS去抑制来抑制与熟悉的小鼠的社交互动。人类可能患有社会分离焦虑障碍，表现为“异常强烈的恐惧或焦虑，与他们感到强烈的依恋者分离”。患者在讨论或经历脱离依恋形象以及拒绝离开依恋形象时表现出不寻常的痛苦。此外，CRH还参与了各种焦虑症，包括社交恐惧症。社交焦虑障碍的一个潜在原因，如分离焦虑障碍或回避型人格障碍，可能是患者在PFC中表现出较低的CRH水平，阻止他们寻求社交新奇性的重要原因。

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