小胶质细胞是中枢神经系统的先天免疫细胞，通过支持神经元的成熟和完善突触连接，积极参与大脑的发育。这些细胞具有高度的代谢灵活性，能够氧化不同的能量底物以满足它们的能量需求。乳酸在大脑中特别丰富，但小胶质细胞是否使用它作为代谢燃料尚不清楚。
2023年9月16日洛桑大学生物医学科学系Rosa Chiara Paolicelli研究团队在Nature communications发表论文“Loss of microglial MCT4 leads to defective synaptic pruning and anxiety-like behavior in mice”。揭示了小胶质细胞MCT4的缺失导致小鼠突触修剪缺陷和焦虑样行为。
在这里，作者表明，小胶质细胞可以输入乳酸，这是结合增加溶酶体酸化。在体外，小胶质细胞中单羧酸转运体MCT4的丢失阻止了乳酸诱导的溶酶体调节，体内MCT4的小胶质细胞缺失导致突触棘受损，与海马神经元兴奋增加、AMPA/GABA比值增强、癫痫发作易感性和焦虑样表型相关。总的来说，这些发现表明，小胶质细胞中MCT4转运体的选择性破坏足以改变突触的细化，并诱导小鼠大脑发育和成人行为的缺陷。
图一 小胶质细胞是代谢多功能的细胞，可以有效地输入乳酸
为了评估代谢灵活性的转录基础，作者分析了从成年Cx3cr1GFP小鼠大脑中急性分离出来的小胶质细胞的表达谱与主要细胞内KEGG代谢通路的关系。发现每个代谢途径中的大部分基因都在小胶质细胞中高表达。通过模块评分分析了小胶质细胞中KEGG通路基因的表达。与其他类型的细胞相比，小胶质细胞在氧化磷酸化和糖酵解方面显示出相对较高的模块评分。总之，这些数据表明了小胶质细胞在原则上具有代谢多种能量底物的内在能力。LDHB是参与小胶质细胞代谢调节的最丰富的基因之一。此外，LDHB在成年小鼠海马的所有其他脑细胞类型中的小胶质细胞中高度富集，其在这些细胞中的表达在出生后的第二周达到高峰，这是一个高度突触重塑的时间。由于含LDHB的亚型在优先将乳酸转化为丙酮酸的细胞中富集，推测其在小胶质细胞中的高水平可能是乳酸代谢的重要作用的基础。作者通过质谱证实，与对照组相比，暴露于20 mM乳酸钠的初级小胶质细胞的乳酸水平增加了约4倍，表明这些细胞中有显著的乳酸输入。这些发现支持了小胶质细胞能够内化细胞外的乳酸。
图二 乳酸转运体MCT4在小胶质细胞中响应细胞外乳酸而上调，是乳酸依赖性溶酶体酸化所必需的
乳酸可以通过一类质子连接的溶质载体成员通过细胞膜运输，SLC载体携带一个羧酸基的分子，如乳酸、丙酮酸和酮，因此定义为单羧酸转运体。在包含MCTs家族的14个亚型中，大脑中高度丰富的乳酸转运体是MCT1、MCT2和MCT4，它们也在小胶质细胞中表达。在暴露于25 mM乳酸钠24小时后，仅观察到原代小胶质细胞中编码MCT4的Slc16a3转录本显著上调，而MCT1或MCT2没有任何变化。乳酸暴露也显著在蛋白水平上增加了MCT4，这些发现支持了MCT4在小胶质细胞对细胞外乳酸可利用性的反应中的直接作用。接下来进一步阐明MCT4的下游调控作用。在氧化细胞中，乳酸输入已被证明通过LDHB活性介导溶酶体酸化和蛋白水解功能。考虑到LDHB在小胶质细胞中的高表达，以及它们内化乳酸的能力，对溶酶体酸化的影响是由乳酸特异性诱导的，而不是由其他单羧酸盐。这些发现表明，细胞外乳酸导致小胶质细胞中晚期核内体和溶酶体的酸化增强，而这严格依赖于MCT4转运体。缺乏MCT4的小胶质细胞显示出乳酸诱导的降解细胞器酸化缺陷，提示其吞噬功能可能受到损害。
图三 在小胶质细胞中选择性消耗MCT4会损害吞噬作用
溶酶体腔内pH对于底物货物的最佳降解至关重要。因此，作者想知道小胶质细胞MCT4的缺失是否会导致小胶质细胞吞噬能力的功能障碍。为此，在对照组和KO原代细胞中进行了DQ-BSA检测。DQ-BSA是蛋白酶的荧光底物，其荧光通过BODIPY染料标记而被猝灭。当DQ-BSA被蛋白酶水解为单肽时，猝灭被缓解，因此，荧光信号可以作为蛋白水解活性的代理。信号定量结果显示，与对照组相比，KO小胶质细胞中产生的荧光显著降低，表明其降解能力存在缺陷。作者想探究在体内乳酸的功能反应是否也可能发生改变，从而影响MCT4 cKO小鼠的小胶质细胞介导的突触重构。乳酸在围产期的大脑中特别丰富，这与该代谢物在早期发育窗口的关键作用相一致。因此，开始通过MCT4 cKO小鼠系来研究小胶质细胞对乳酸驱动的大脑发育影响的具体作用。海马是一个与认知功能高度相关的结构，在出生后早期通过小胶质细胞进行深刻的突触细化。测量了野生型小鼠在出生后15天大脑中的乳酸，并将其在海马体中的水平与更多尾侧新皮质区域进行了比较。质谱分析显示，海马体中的乳酸含量明显高于其他新皮质区域，这支持了该代谢物在该结构中的作用。为了阐明小胶质细胞乳酸转运在海马发育中的作用，通过在Cx3cr1CREert2/+的P6和P8选择性地消耗小胶质细胞中的MCT4；结果发现MCT4 KO小胶质细胞中吞噬溶酶体大小的增加可能反映了摄取物质的功能失调清除，这可能包括突触物质。
图四 MCT4 cKO小鼠的突触剪枝缺陷
出生后的早期几周是大脑的一个关键发育窗口，其中小胶质细胞的突触修剪与促进突触连接的适当细化特别相关。因此，作者假设MCT4 cKO小鼠，如果在小胶质细胞酰化清除方面有缺陷，将会表现出突触结构的积累。因此，对P15小鼠的海马匀浆进行了免疫印迹分析，在海马切片上的免疫染色进一步证实突触素显著增加。对突触前和突触后标记物和homer1之间的共定位斑点进行定量，发现突触数量显著增加，支持MCT4小胶质细胞缺失引起的结构变化。对照同窝小鼠相比，MCT4 cKO之间的树突棘密度没有变化，与突触后支架蛋白homer1和PSD95的水平没有变化相一致。这些数据表明，小胶质细胞中MCT4的选择性丢失不仅会导致内在的小胶质细胞功能障碍，而且足以在突触水平上诱发后果。为了进一步研究突触标记物的增加是否与体内小胶质细胞修剪缺陷直接相关，作者评估了对照组和cKO小鼠CA1海马区小胶质细胞对突触蛋白的吞噬情况。在cKO小鼠中，被吞噬的突触斑点的数量明显增加，这与体外观察到的有缺陷降解和随后产生的摄入物质的积累相一致。总的来说，这些数据突出了小胶质细胞MCT4在介导出生后早期海马体突触消除中的关键作用。
图五 小胶质细胞MCT4的缺失会在海马体中产生突触适应和代谢变化
接下来，作者研究了MCT4 cKO小鼠的缺陷突触重构是否对海马神经元的神经传递有功能性影响。从幼年小鼠中制备急性脑切片，并对CA1锥体细胞进行膜片钳记录。与对照组相比，在cKO小鼠中记录的自发性兴奋性突触后电流的振幅显著升高，sEPSC的频率也有相似的趋势。这些结果表明CA1锥体神经元有更大的突触兴奋，这一现象与突触蛋白和GluA2等突触蛋白水平的变化相一致。此外，在P15小鼠的海马切片中， cKO小鼠的锥体神经元的AMPA/GABA比值增加。小胶质细胞功能障碍和CA1锥体细胞上更高的突触兴奋先前已经被认为与提供癫痫发作的易感性有关。在对照组小鼠中，腹腔注射2 mg/kg的红藻氨酸并没有引起任何与癫痫发作相关的反应。然而，100%的cKO雄性和雌性早在注射后1小时就出现了阵挛性发作。这些数据证实了小胶质细胞MCT4的缺失导致了幼年小鼠海马体突触结构和功能的改变。对三羧酸循环的分析显示，中间代谢产物琥珀酸显著增加，这与其在促进癫痫发作中的积累作用一致。由于脂肪酸、葡萄糖和氨基酸的代谢可以产生ACs，在cKO小鼠中发现的高水平可能表明，在没有小胶质细胞MCT4的情况下，存在代谢适应。
图六 成年cKO小鼠表现出类似焦虑的行为
在大脑发育过程中，小胶质细胞介导的回路重构的缺陷往往会导致长期的行为后果。因此，为了研究小胶质细胞出生后早期MCT4的缺失是否会导致成年期的行为改变，作者进行了几项行为测试评估小鼠行为。证实了小胶质细胞中MCT4的消耗是长期的，在成年期cKO的显著降低。小鼠首先在旷场试验中进行测试，以评估基本的运动活动和类似焦虑的行为。虽然性别和基因型之间的运动和静止时间具有可比性，但与对照组相比，成年cKO雄性探索矿场中心的时间明显更少，在中心行走的距离也更短，表明焦虑增加。该行为在高架十字迷宫试验中得到了证实，在该试验中，cKO雄性在闭合臂上停留的时间明显更多，它们也表现出更多的静止时间，在高架十字迷宫的探索和平均速度显著降低。此外，作者还分析了小鼠的自我梳理的行为，包括对新环境的反应和对物理刺激的反应。与对照组相比，cKO雄性在两种梳理中表现出相似的水平，而cKO雌性在喷雾诱导的梳理中表现出显著的减少。最后，作者还使用巴恩斯迷宫和Y迷宫测试了运动表现、空间记忆和工作记忆。在这些测试中没有发现任何差异，这表明空间记忆和运动协调不受小胶质细胞MCT4缺失的影响。总的来说，这些数据支持了cKO小鼠焦虑样行为的长期改变，伴随着结构突触的改变，表明小胶质细胞MCT4的缺失足以影响成年期复杂的大脑功能和突触的完整性。
总之，作者发现小胶质细胞乳酸输入通过MCT4依赖的机制调节溶酶体酸化。MCT4的选择性小胶质细胞消耗会导致吞噬功能受损和突触修剪的改变。在功能上，这与海马神经元兴奋增加、红藻氨酸诱发癫痫的易损性增强以及成年cKO动物焦虑样表型的发作有关。
https://doi.org/10.1038/s41467-023-41502-4
特别鸣谢
联系客服
