神经组织染色法

一、神经元

（一）胞体

Golgi 镀银法

结果：神经元胞体及树突（可见树突棘及小芽）轴突呈黑色，背景淡黄色或无色。能显示神经胶质细胞（星形胶质细胞）、毛细血管周细胞等。

用途：神经元；硬骨哈佛氏系统的骨小管；腺细胞的细胞内分泌小管及肝毛细胆管等

Golgi法Ⅰ

方法：

⑴从已固定的整脑切取小块或取新鲜脑组织厚1厘米，浸于10%甲醛（新鲜组织至少固定24小时），或入重铬酸钾甲醛液（3.5%重铬酸钾水溶液3份，甲醛1份），蒸馏水略洗。

⑵转入3.5%重铬酸钾水溶液3天（第三天起，每天取一块组织按下列步骤处理），每天换新液一次。

参考时间（Hardesty):

神经胶质细胞2~3天

大脑皮质细胞3~4天

小脑皮质细胞4~5天

脊髓灰质4~5天

轴索及无髓神经纤维5~7天

⑶将组织块以少量0.75~1%硝酸银水溶液洗数次至不出现红褐色沉淀，再放入大量硝酸银水溶液暗箱2~6天（每100毫升加甲酸数滴），隔日换硝酸银水溶液一次；蒸馏水略洗。

⑷用锋利刀片切一小薄片已镀银组织，滴少量甘油镜检，如不满意，可重复上述步骤。

组织块经95%酒精和无水酒精各2小时，乙醚酒精等量混合液1小时，4~5%火棉胶1~2小时；10%火棉胶1~2小时，氯仿硬化火棉胶，切片20~100微米。

⑸经95%酒精 ，用吸水纸沾净，入下液透明：

石炭酸结晶（白色）（Carbolic acid）10克，甲苯（Toluene）或二甲苯（dimethylbenzene）80毫升，木馏油（Creosote）10毫升

⑹将切片捞在载玻片上，用吸水纸沾净，用树胶甲苯液、加拿大胶或山达胶液冲洗几次，除去石炭酸

山达胶液：山达胶75克，樟脑15克，松节油30毫升，熏衣草油22.5克，无水酒精75毫升，蓖麻油5~10滴

⑺如用山达胶封片，可于切片经95%酒精后用吸水纸吸净，直接滴胶即透明、封固。

不加盖玻片置避尘处阴干。

Golgi法Ⅱ

⑴取狗、猫、兔等新鲜大脑固定于10%甲醛液7天以上。

⑵将大脑用滤纸吸干表面的固定液。

⑶直接入下液24~48小时（室温，中间换一次液）：

5%铬酸钾100毫升，冰醋酸6~8毫升

或者：重铬酸钾5 克，水合氯醛3克，蒸馏水100毫升

⑷0.75%硝酸银水溶液及1%硝酸银水溶液各1天（37~40℃），中间换一次新液；用蒸馏水速洗。

⑸立即入95%酒精40~60分钟（换一次液）

⑹入无水酒精30~60分钟（换一次液）。

⑺入等量乙醚酒精液30~60分钟。

（脱水时间适当：过短，脱水不净；过长，组织块褪色）

⑻入5%火棉胶1~2小时，10%火棉胶2~3小时，15%火棉胶2~3小时，用20%火棉胶包埋。

上述浸胶时间只能达到脑的表面层

⑼常规火棉胶切片50~100微米。

⑽快速脱水 、透明、常规表片，不加盖玻片。

结果：锥体细胞、原浆性和纤维性星形胶质细胞呈棕黑色。

（二）神经原纤维

Golgi镀银法

快法和慢法。常用快法。

快法：显示神经细胞胞体和突起（树突和轴突）。仅显示部分神经细胞及其突起，所显示的部分细胞散在于各处不同部位。易于观察神经细胞各结构之间的关系。但不易掌握，重复性不理想。对重组组织成功率较高，成年脑组织有时结果也较满意。结果是神经细胞胞体及树突（树突棘及小芽）轴突呈黑色，背景为淡黄色或无色。也能显示神经胶质细胞（主要是星形胶质细胞）和毛细血管周细胞。也可显示硬骨哈佛氏系统的骨小管、腺细胞的细胞内分泌小管及肝毛细胆管（胆小管）等。

Cajal镀银法Ⅰ

⑴取已固定的整脑切取小块或取新鲜脑组织厚1厘米浸于10%甲醛液（新鲜组织固定至少24小时），或入下液固定。

3.5%重铬酸钾水溶液3份，甲醛液1份

⑵水略洗，转入3.5%重铬酸钾水溶液3天左右（可在第三天起，每天取一块组织按下法处理），每天换一次新液。

Hardesty对各种神经组织固定参考时间：

神经胶质细胞 2~3天

大脑皮质细胞 3~4天

小脑皮质细胞 4~5天

脊髓灰质 4~5天

轴索及无髓神经纤维 5~7天

⑶将组织块以少量0.75~1%硝酸银水溶液荡洗数次至无红褐色铬酸银沉淀出现，放入大量硝酸银水溶液（100毫升加甲酸数滴）暗箱2~6天。隔日换银液一次。

⑷水速洗一次。用锋利刀片切一小薄已镀银组织，滴少量甘油镜检。如不满意重复上述相关步骤。

⑸经95%酒精及无水酒精各2小时，乙醚酒精等量混合液1~2小时，10%火棉胶1~2小时，按火棉胶硬化及切片处理。

⑹切片厚20~100微米。经95%酒精速用吸水纸沾净，入下列透明液：

石炭酸（白色结晶）10克，甲苯或二甲苯80毫升，木馏油（Creosotum）10毫升

⑺捞在载玻片上，吸水纸沾净，用合成树胶甲苯液或加拿大胶或下列山达胶封片（加胶前用甲苯或二甲苯洗数次可除去石炭酸）。

山达胶（ Gum sandarac）75克，樟脑（camphor）15克，松节油（turpentine oil）30毫升，熏衣草油（Lavander oil）22.5克，无水酒精（alcohol anhydrous）75毫升，蓖麻油（Castor oil）5~10滴

⑻如用山达胶封片：切片经95%酒精，用吸水纸沾净，直接滴胶封固。

⑼不加盖玻片，置避尘处阴干。

CajalⅡ

⑴狗、猫、兔等新鲜大脑固定于10%福尔马林至少7天。

⑵用滤纸沾干脑表面固定液，直接入下述A液或B液24~48小时（换一次新液）。

A液：5%铬酸钾（Potassium chromate））水溶液100毫升，冰醋酸6~8毫升

B液：重铬酸钾（potassium dichromate）5克，水合氯醛（Chloral hydrate）3克，蒸馏水100毫升

⑶入0.75%硝酸银（Silver nitrate）水溶液、1%硝酸银水溶液各1天（37~40℃），中间各换一次新液。

⑷蒸馏水速洗。立即投入95%酒精40~60分钟（换一次液）；无水酒精30~60分钟（换一次液）；等量乙醚（Ether）酒精30~60分钟。（过短，脱水不干净；过长，引起组织块褪色）

⑸入5%火棉胶（collodion ）液1~2小时，10%火棉胶液2~3小时，15％火棉胶2~3小时，20%火棉胶包埋。

⑹常规火棉胶切片50~100微米，快速脱水、透明、贴片，不加盖玻片。

结果：锥体细胞、原浆性星形胶质细胞和纤维性星形胶质细胞呈棕黑色。A液比B液好：锥体细胞多，少沉淀。

铬液变黑表示失效，应换液1~2次。浸银可从0.75%开始经1%或1.5%，逐步增加浓度，减少沉淀。

Cajal氨酒精法Ⅲ

方法：

⑴组织（可先用75%酒精固定3~5小时）固定于氨（Ammonia）酒精24~48小时，用吸水纸沾干。

氨酒精：95%酒精50毫升，氨水（28%）4~6滴

氨酒精（大脑皮质细胞）：95%酒精50毫升，氨水（28%）3滴

氨酒精（小脑、神经节、脊髓）：95%酒精50毫升，氨水（28%）4滴

氨酒精（脑干、脊髓大细胞）：95%酒精50毫升，氨水（28%）10滴

⑵入1.5%硝酸银水溶液4~5天（组织2~4毫米厚、37C间处）至组织呈淡灰黄色（淡黄色为不足，深灰至褐色为过度），水洗数次（1分钟）使表面的银液不重）。

⑶入还原液24小时（小块组织18小时），水洗一次。

还原液：焦性没食子酸（Pyrogallol）或对苯二酚（hydroquinone）1克，蒸馏水100毫升，甲醛（Formaldehyde）5~10毫升。可加亚硫酸钠（sodium sulfite）0.1~0.5克防止还原过早失效。

⑷经70%酒精上行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片10微米左右。

⑸切片烘干后脱蜡，经酒精下行至水。

⑹可用1：500氯化钠(Sodium chloride)调色（或不要）及用5%硫代硫酸钠水溶液定影，水洗。

⑺常规脱水 ，透明，封片盖片。

结果：纤维、细胞黑色，背景黄褐色。

适于大型细胞显示。

Cajal吡啶法Ⅳ

适于神经组织发生期，对周围神经末梢及神经纤维再生能较好显示，神经原纤维极清晰，背景黄色。

方法：

⑴吡啶（Pyridine）加适量蒸馏水固定12~24小时，或在蒸馏水25毫升加吡啶25~30毫升固定6~8小时，再换纯吡啶固定18~24小时。

⑵流水冲洗12小时至无吡啶味。

⑶95%酒精12~24小时，用吸水纸沾干。

⑷入1.5%硝酸银水溶液4天（37℃，暗处）

⑸入还原液24小时（小块组织18小时），水洗一次。

还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1克，蒸馏水100毫升，甲醛5~10毫升。可加亚硫酸钠0.1~0.5克防止还原过早失效

⑹经70%酒精上行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片10微米左右。

⑺切片烘干后脱蜡，经酒精下行至水。

⑻可用1：500氯化钠调色（或不要）及用5%硫代硫酸钠水溶液定影，水洗。

⑼常规脱水 ，透明，封片盖片。

Cajal水合氯醛法Ⅵ

很适于神经终末如运动终板、突触及脊神经节假单极神经元突起等显示。

⑴组织固定于水合氯醛液24小时，水冼一次数分钟。

水合氯醛液：水合氯醛5.5克，无水酒精25毫升，蒸馏水75毫升

⑵氨酒精24小时，用吸水纸沾净。

氨酒精：95%酒精 50毫升，氨水3~4滴

⑶1.5%硝酸银水溶液37C 4~6天（暗处）（室温延长一倍时间），镀银均匀，背景淡。

⑷入还原液24小时（小块组织18小时），水洗一次。

还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1克，蒸馏水100毫升，甲醛5~10毫升。可加亚硫酸钠0.1~0.5克防止还原过早失效

⑸经70%酒精上行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片10微米左右。

⑹切片烘干后脱蜡，经酒精下行至水。

⑺可用1：500氯化钠调色（或不要）及用5%硫代硫酸钠水溶液定影，水洗。

⑻常规脱水 ，透明，封片盖片。

Holmes镀银法

方法：

⑴组织用10%甲醛固定或灌注固定，流水冲洗12小时或更长。

⑵常规脱水，石蜡包埋切片。

⑶切片烘干，脱蜡下行酒精至水。

⑷20%硝酸银水溶液1小时（暗处），换蒸馏水三次共10分钟或速洗。

⑸入银液12~24小时（37℃），每一切片银液量不少于20毫升。

银液：0.2M硼酸（Boric acid）（12.368克/1000毫升）55毫升、0.2M硼砂（Borax）（19.071克/1000毫升）45毫升，pH8.4，加蒸馏水洗至494毫升，加1%硝酸银水溶液1毫升，加10%吡啶水溶液5毫升，摇荡后混合，新鲜使用 。

⑹取出切片，甩干。

⑺入还原液2~3分钟。

还原液：对苯二酚1克，无水亚硫酸钠5克，蒸馏水加至100毫升

⑻流水冲洗3分钟，蒸馏水洗一次。

⑼0.2%氯化金[Gold (III) chloride]水溶液调色3分钟，水洗。

⑽入2%草酸（Oxalic acid）水溶液3~10分钟至神经元逐渐由红变深红至黑色，水洗。

⑾固定于5%硫代硫酸钠（Sodium hyposulfite）水溶液 5分钟，充分水洗。

⑿常规脱水，透明，封片。

结果：神经元及神经纤维黑色。

切片在水洗、脱水至95%酒精时，可用0.1%劳克坚牢蓝（Luxol fast blue)95%酒精溶液染髓鞘1小时（37℃），95%酒精 洗，蒸馏水洗。0.5~1%碳酸锂（ Lithium carbonate）水溶液分色。70%酒精分色至灰质与白质分清，水洗，脱水 ，透明，封片。

结果：细胞暗红色，纤维黑色，髓鞘蓝色。

Cajal-Favorasky镀银法

方法：

⑴组织块勿厚于5毫米，在70~80%酒精固定24小时。脑组织或其它软组织在50毫升固定液内加甲酸（Formic acid）30滴，神经末梢或硬组织加冰醋酸（Acetic acid）30滴。

⑵80%酒精略洗，换一次。浸5~24小时（修块厚度2~3毫米）

⑶入氨酒精2天，蒸馏水洗若干次至组织块沉底，沾干。

大、小脑，脊髓，神经节：95%酒精50毫升加氨水4滴；

脑干：95%酒精50毫升加氨水9滴

⑷入纯吡啶1~2天，流水冲洗至无吡啶味（24小时）。

⑸蒸馏水洗3~6小时或过夜，换数次。

⑹1.5%硝酸银水溶液37℃ 7天或10天，换2~3次液（预热至37℃），蒸馏水速洗。

⑺还原液1~2天，水洗。

还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1~2克，蒸馏水100毫升，中性甲醛10~15毫升

⑻常规脱水，透明，石蜡包埋，切片15微米。

⑼切片脱蜡后封片。

结果：神经原纤维黑色，背景黄色。

二、神经纤维

Bielschowsky-GrosLawrentjew法

方法：

⑴取材迅速，尽可能保持组织新鲜。先切取大些组织块，固定于20%甲醛（pH6.7~7.2)1天，修成1厘米厚的组织块，再固定于12%中性甲醛7天至数月。

Lawrenyjew先固定于95%酒精、1%亚砷酸、20%甲醛1份数小时至1天，不经水洗，直接转入20%甲醛数周。

⑵流水冲洗，冰冻切片20~50微米。

⑶切片入含数滴中性甲醛的蒸馏水1~2小时，换一次液，第二次蒸馏水可不加甲醛。

⑷入20%硝酸银水溶液37℃暗处20分钟至略显黄色。

⑸用扁头玻璃棒捞入盛有20%中性甲醛的培养皿内，依次经四盘，每盘不超过2分钟。当捞入后用玻棒轻搅，可见切片周围出现白色雾状，换入下一培养皿的甲醛液内。

⑹捞出最后一盘内的切片，用滤纸将甲醛沾净。

⑺入氨银液搅动至切片呈淡棕色（室温10分钟）。

氨银液：20%硝酸银水溶液10毫升，逐滴加浓氨水（28%，比重0.88)，随加随摇至棕色沉淀溶净，再加氨水1~3滴。

⑻转入氨水蒸馏水（4：5）5分钟，经多次蒸馏水洗至无味（也可用0.1%冰醋酸水溶液速洗去氨）。

⑼常规0.2%氯化金水溶液调色，水洗。

⑽可用 0.1%伊红水溶液复染。

⑾脱水 ，透明。封片。

结果：神经纤维呈黑色，背景略显棕色或无色。

三、神经末梢

Ranson吡啶银法

方法：

⑴固定于氨酒精48小时，水略洗。

无水酒精100毫升，氨水1毫升

或95%酒精100毫升，浓氨水5毫升

⑵纯吡啶24小时，充分水洗1天。

⑶2%硝酸银水溶液暗处35C，水略洗。

⑷还原24~48小时，水洗。

还原液：焦性没食子酸4克，5%甲醛液100毫升

⑸常规石蜡包埋、切片，烘干，脱蜡，加树胶封片。

结果：对较大块的组织色泽均匀，显示各种神经节良好，胞体呈黄棕色，突起呈黑色，无髓神经纤维 黑色，有髓神经纤维 黄棕色

吡啶银法示毛囊神经末梢

方法：

⑴取小鼠上唇小块组织固定于吡啶蒸馏水等量溶液2天，充分水洗1天除去吡啶味。

⑵浸入大量无水酒精2天，用滤纸沾干。

⑶37℃温箱避光浸1%硝酸银水溶液5天，水急洗。

⑷入还原液1天，水洗。

还原液：蒸馏水40毫升，40%甲醛液10毫升，焦性没食子酸1克

⑸常规脱水 ，透明。石蜡包埋切片。

结果：神经纤维黑色，其它组织黄色。

De Castro内耳双极神经元显示法

方法：

⑴取幼年豚鼠内耳，剔除外表软组织，在下液固定兼脱钙1~5天，以针能刺入骨即可，流水冲洗1天。

水合氯醛5克，95%酒精50毫升，蒸馏水50毫升，浓硝酸（Nitric acid）3~5毫升

⑵氨酒精（95%酒精100毫升，氨水0.5毫升）24小时，用滤纸沾干组织外的液体。

⑶1.5%硝酸银水溶液37℃避光浸7天，隔日换新液一次。

⑷还原2天。

还原液：焦性没食子酸（或对苯二酚）1.5克，甲醛8毫升，蒸馏水100毫升

⑸入70%酒精洗净组织上的黄色调。

⑹常规脱水透明包埋。切片。封片。

结果：骨组织黄色，神经元突起及神经纤维黑色。

肌间神经丛镀银显示法

方法：

⑴幼年豚鼠、兔或猫，或成年豚鼠及兔杀死，迅速剖腹，取小肠一段（数厘米至20厘米），用温热生理盐水注入肠腔，将腔内的污物冲洗干净。

⑵结扎肠段的两端。

⑶用细针头注射器将固定液缓慢注入肠段（穿刺肠壁或通过结扎口），使肠管充满固定剂并膨胀。

固定液：60%酒精90毫升，甲醛10毫升

⑷用固定液将肠管全部固定3~20天。

⑸将肠管剪成约1厘米长的小段，自来水流水冲洗12小时。

⑹大量蒸馏水浸泡24~36小时，换水3~4次。

⑺将肠管沿肠系膜处纵行剪开，肠管平铺成一方形薄片。

⑻用尖镊子或吻合较严的眼科镊（直、弯平头或尖头镊）轻轻撕去黏膜、黏膜下层及环行肌层，撕的动作是镊尖夹紧组织后骤然扯去，最好从四角开始。撕扯可在蒸馏水内进行 。仅留下神经丛在薄的纵行肌层上，在解剖镜下很容易见到。

⑼挑选较满意的神经丛和纵行肌层，放入新配的20%硝酸银水溶液37℃避光5~20分钟（或5%硝酸银水溶液37℃1天），蒸馏水速洗一次（30秒）。

⑽还原5~10分钟，37℃；水洗。

对苯二酚1.5克，中性甲醛3毫升，蒸馏水100毫升

⑾入下液分色。组织变蓝黑色，如变慢或淡，再加氯化金少许。

硫氰化铵（Ammonium thiocyanate）3克，蒸馏水100毫升，加1%氯化金水溶液1~2毫升

⑿如色调过深，可用下液减薄。

2%硫代硫酸钠水溶液10毫升，10%铁氰化钾（赤血盐potassiumferricyanide）水溶液10滴

⒀流水冲洗10分钟。

⒁可用伊红（Eosin Y/B)复染。

⒂常规脱水，透明，封片。

结果：神经元胞体、突起、纤维黑色，纵行平滑肌淡灰色，复染为红色。

Rager改良银染法

方法：

⑴组织固定于下液3~4天，脱水透明，石蜡包埋，切片10~20微米。

37%甲醛液5毫升，冰醋酸5毫升，80%酒精90毫升

⑵切片粘片、烘干。

⑶经甲苯脱蜡下行入水，

⑷在1%铬酸( Chromic acid)水溶液10~30分钟（37℃），蒸馏水洗15分钟（随洗随换）。有助于改善染色与背景的对比（用1%重铬酸钾或5%甲醛的pH7.4，0.1M磷酸盐缓冲液均各2小时/37℃代替）。

⑸0.01%硝酸银的0.1M硼酸-硼砂缓冲液pH8.0)溶液镀银16~24小时（37℃避光），水速洗。

⑹0.5%醋酸水溶液洗20分钟（换两次），水洗。

⑺还原5~10分钟至切片呈灰褐色，在0.5%醋酸水溶液5分钟。

还原液：

A液：无水碳酸钠(Sodium carbonate)50克，蒸馏水洗1000毫升

B液：硝酸铵(Ammonium nitrate)2克，硝酸银2克，无水矽钨酸（Tungstogilicic acid)10克，蒸馏水1000毫升

C液：37%甲醛液7毫升，B液1000毫升

先将B液7毫升慢慢加入A液10毫升，随加随猛烈摇荡；再慢慢加入C液3毫升）。

⑻用1%氯化金水溶液调色。

⑼常规脱水，透明，封片。

结果：神经纤维黑色。

Ranvier氯化金改变法（运动终板、肌梭、腱梭、环层小体）

氯化金压片法，很完整

方法：

⑴取材：运动终板、肌梭和腱梭取自小白鼠肋间肌或腓肠肌；环层小体取自幼猫肠系膜。肌肉厚度不超过3毫米。

⑵固定：组织固定于20%甲酸（蚁酸）25分钟至半透明；或柠檬汁固定10~60分钟。甲酸固定的组织颜色偏蓝，很不美观且与神经纤维不易区别。

或改用下液固定至呈半透明，肌组织、环层小体呈红紫色，神经纤维黑色。

枸橼酸(Citric acid)10~20克，葡萄糖(glucose )5~7克，1%氯化金水溶液0.5~1毫升，蒸馏水100毫升

⑶用干净滤纸沾干。

⑷1%氯化金水溶液暗处浸15~60分钟至肌组织呈金黄色（棕色表示过度）。

⑸直接入25%甲酸过夜（8~12小时）或20%甲酸一天，放暗箱内。

⑹组织呈红紫色，神经纤维呈黑色表示还原完成；组织呈紫色为过度，蓝色为太过度，应弃去。

⑺蒸馏水换洗若干次，用滤纸沾干。

⑻浸入下液备检，可放较长时间。

甘油(Glycerol)10毫升（中性、CP），50%酒精10毫升

⑼取出组织，放在载玻片上，滴加少量甘油，用针轻拨组织，加盖玻片并轻压，镜检。如可用，用树胶加盖玻片封固。

结果：肌肉、环层小体、肌梭、腱梭红紫色；神经纤维黑色。

*镀金后，将肌组织 放于淡醋酸（1：500）水溶液，放强阳光下曝晒若干小时，也达到 还原目的。封片时压挤挤应注意用力，防止神经末梢与神经纤维碎裂。

四、溃变神经纤维

Nauta法（1957）

⑴组织固定于10%福尔马林2~6月（第一个月内换液两次）。

⑵冰冻切片30~50微米。

⑶切片入10%福尔马林液。

⑷每次 5~20片，水略洗。

⑸0.5%磷钼酸(Phosphomolybdic Acid)水溶液15~30分钟，速洗。

⑹0.025~0.05%高锰酸钾（Potassium permanganate）水溶液分别以试片处理5分钟、10分钟及15分钟。（抑制正常神经纤维）

⑺1%草酸-1%对苯二酚等量混合液至少2分钟，蒸馏水充分洗涤。

⑻1.5%硝酸银水溶液为15~30分钟，水洗两次。

以后逐片处理：

⑼Laidlaw氨银液不断摇荡45~60秒。

Laidlaw氨银液配制：

①在250毫升量杯内溶解硝酸银 12克于双蒸水20毫升；

②230毫升于碳酸锂（9℃溶解度为1.33%)溶液立即产生沉淀，猛摇。

③待沉淀下沉至70毫升刻度时，小心倾去上清液，再加蒸馏水至250毫升刻度处，再摇动，静止，待沉淀下沉至70毫升刻度处，再次倾去上清液。反复进行3次。

④待沉淀下沉至70毫升刻度处，小心倾去上清液。边加摇，慢慢滴加浓氨水至溶液几乎透明为止（约需9.5毫升）。配好后略有氨味。

⑤蒸馏水稀释至120毫升，过滤于洁净的瓶内，置白昼光下至少2周，见瓶壁上有一层银色物质，用前过滤。

⑽切片直接入还原液，不断轻摇约1分钟，切片呈棕色，直到2分钟为止。如还原时间过久，颜色太暗，可在每20毫升银液内加氨水4滴，如颜色太淡，加2.5%氢氧化钠水溶液数滴于银液。

还原液：10%甲醛13.5毫升，1%枸橼酸水溶液13.5 毫升，95%酒精45毫升，蒸馏水400毫升

⑾速经水洗，浸于1%硫代硫酸钠水溶液1分钟，再用蒸馏水洗数次。

⑿用Albrecht明胶酒精封片。

⒀切片经蒸馏水洗，入等量1.5%明胶(Gelatin)及80%酒精约5分钟；捞到载玻片上，用新滤纸略吸干；95%酒精最后凝固明胶。

⒁脱水、透明、封片。

结果：溃变神经纤维粗细不一，染呈黑色，背景黄褐色；正常轴索呈黑色。溃变的神经纤维所终止的细胞可见有溃变的细胞周围或树突周围纤维。胞体及树突近侧端染成淡褐色。某些溃变神经纤维如小脑溃变的攀援纤维等染色效果不好。

Fink-Heimer法（1967）

对选择性显示溃变的轴索及突触末梢，用硝酸铀代替硝酸银，抑制正常纤维到最少量。

⑴用生理盐水灌注动物，再用10%甲醛或甲醛生理盐水灌注，小心取材，固定于10%甲醛1~2周。

⑵切取组织块浸于30%蔗糖（Sucrose ）水溶液2~3天或稍长。开始 时组织块浮于蔗糖液上。

⑶不经水洗，直接冰冻切片15~30微米。

⑷入1%甲醛液内（由浓蔗糖内取出的组织块不易冷冻），水略洗。

⑸浸于0.05%或0.025%高锰酸钾水溶液5~15分钟，水洗。

⑹1%等量草酸及对苯二酚水溶液漂白30~60秒，蒸馏水充分洗涤，转入下液30~60分钟。

0.5%硝酸铀（Uranyl nitrate）水溶液10毫升，2.5%硝酸银水溶液12毫升，蒸馏水 28毫升

⑺直接转入下液30~40分钟，充分水洗。

0.5%硝酸铀水溶液20毫升，2.5%硝酸银水溶液30毫升

⑻转入新配的下液1~5分钟。

2.5%硝酸银水溶液30毫升，浓氨银液1毫升，2.5%氢氧化钠（sodium hydroxide）水溶液1.8毫升

⑼不经水洗，直接转入Nauta-Gygax液还原两次，每次1~2分钟，水洗。

还原液：蒸馏水910毫升，95%酒精90毫升，10%甲醛液27毫升，1%枸橼酸水溶液27毫升

⑽入0.5%硫代硫酸钠水溶液1分钟，水洗。

⑾常规脱水、透明、封片。

结果：中枢神经系统溃变纤维及其突触末梢黑色。

Ebbesson-Robinson双重银法（1970）

⑴动物手术后，经存活期3~7天。

⑵固定于10%甲醛2周以上，水洗。

⑶20~25%明胶包埋 。

⑷冰冻切片20~40微米，收集于10%福尔马林盘内。

⑸切片换水洗1~2小时。

⑹0.2%硝酸铀水溶液7小时，水洗3次共10分钟。

⑺0.01%高锰酸钾水溶液12小时，最初1小时换新液，以后 经常摇荡，切片呈棕色。

⑻蒸馏水洗若干次，10分钟。

⑼对苯二酚-草酸水溶液漂白1分钟，蒸馏水洗若干次约1分钟。

1%对苯二酚1份，1%草酸水溶液1份。用前混合。

⑽0.5%硝酸银水溶液避光30分钟。

⑾先后分别入下列氨银液两盘，不断摇动，共2~4分钟。

1.5%硝酸银水溶液60毫升，无水酒精36毫升，2.5%氢氧化钠水溶液50～54毫升，1.5%硝酸银水溶液60毫升，无水酒精36毫升，2.5%氢氧化钠水溶液50~54毫升，浓氨水10毫升

无水酒精加1.5%硝酸银水溶液，摇荡，滴加2.5%氢氧化钠水溶液，产生棕黑色沉淀。再滴浓氨水，使沉淀恰好溶解。

⑿切片不洗，入两缸还原液。第一次略荡后在第二缸内约2分钟，切片背景呈金黄色。

还原液：蒸馏水400毫升，10%甲醛10毫升，1%枸橼酸水溶液15毫升，无水酒精50毫升，菲尼酮（Phenidone)0.1克

⒀水洗后，入1%硫代硫酸钠水溶液1分钟，水洗10分钟。

⒁可将切片贴于涂有蛋白甘油的载玻片上略烘干。经95%酒精等上行脱水，透明，树胶封片。

结果：背景金黄色；核群的神经细胞胞体轮廓清晰；少量正常神经纤维呈黄棕色 ；溃变的神经纤维为黑色串珠状、断线状或粉尘样。

五、神经胶质细胞

Del Rio-Hortega碳酸银法显示小胶质细胞（Panfield改良法）

⑴用乙醚麻醉健康成年兔，灌注固定1000毫升：

40%甲醛14毫升，溴化铵（Ammonium bromide）2克，蒸馏水100毫升

⑵取下整脑于固定液中，4小时后，切下视区皮质，修切成厚约5毫米、宽10毫米大小的组织块，重换固定液 ，继续固定5~14天。

⑶冰冻切片20~25微米。

⑷1%氨水过夜（换液三次）除去福尔马林，盖紧瓶盖，防止氨气v挥发。

⑸切片稍用滤纸吸干，直接进入5%Globus溴氢酸，直37℃温箱1小时（换液一次），蒸馏水洗三次。

Globus 液：40%氢溴酸（Hydrogen bromide）5毫升，蒸馏水100毫升

⑹5%碳酸钠水溶液媒染4~5小时（换三次），蒸馏水洗。

⑺或直接入弱碳酸银水溶液3~5分钟（每次3~4片）。

碳酸银水溶液：10%碳酸银水溶液5毫升，加5%碳酸钠水溶液20毫升，立即产生乳白色沉淀。加浓氨水，直到沉淀恰好溶解，再加蒸馏水75毫升，过滤备用。现用现配。

⑻1%福尔马林还原三次共20~30秒，蒸馏水洗。

⑼0.2%氯化金水溶液调色30~40秒，至切片呈深灰色，蒸馏水洗。

⑽5%硫代硫酸钠水溶液固定2~3分钟，蒸馏水洗。

⑾1%明胶水溶液，将切片贴于载玻片上，略晾干。

⑿经95%酒精、无水酒精二次及无水酒精二甲苯等量混合液各5~10分钟，二甲苯透明三次，封片。

结果：小胶质细胞呈深灰至黑色，少量少突胶质细胞呈深灰至黑色。

*对固定5~6天的标本效果最好。氨银液、1%福尔马林和0.2%氯化金只能使用1~2次，及时换新液。

Grono法显示少突胶质细胞

⑴取成兔中脑或延髓组织块厚5毫米，固定24~48小时。

固定液：尿素（Urea）4克，碘化钾（Potassium iodide）6克，40%甲醛20毫升

⑵冷冻切片15微米，置于蒸馏水中。若不染色，可在10%福尔马林保存1~2周。

⑶蒸馏水洗数次。

⑷入3%双氧水 (hydrogen peroxide)溶液（ pH2.4)30秒。

⑸入10%过氧化氢水溶液10秒。

⑹入钨铵银液染色8~12秒。

10%硝酸银水溶液1份，10%钨酸钠水溶液1份

两液混合，生成黄色沉淀，逐滴加氨水至沉淀溶解。取该液10毫升加吡啶1滴，30分钟后过滤使用。

⑺1%福尔马林还原2~3分钟（每次换新液），蒸馏水洗。

⑻0.2%氯化金水溶液调色至切片呈灰色为止。

⑼5%硫代硫酸钠水溶液固定10~30秒，蒸馏水充分洗涤。

⑽1%明胶水溶液，将切片贴在载玻片上，晾干。

⑾脱水、透明，加树胶封固。

结果：背景灰白，少突胶质细胞黑色，有时可见少量小胶质细胞。

注：室温 20℃左右容易显示。过氧化氢溶液新鲜以30%为好。切片在过氧化氢中时间不宜过长。银染时先膈切片浮于银液表面，用玻棒在切片下轻轻搅动，可见小气泡自下而上冲各切片，附于切片底面，气泡由小而大，布满瑜片，切片开始自动旋转，表示镀银完成，用玻棒挑起切片放入甲醛液内还原。超过15秒，神经细胞出现而少突胶质细胞不能显示或显示不完全 。

Marchalls镀银法显示小胶质细胞和少突胶质细胞

⑴取兔新鲜大小脑组织块（不超过1厘米），固定于10%甲醛生理盐水2~4天或更长。冰冻或石蜡切片。

⑵冷冻切片20~25微米。

⑶经蒸馏水略洗。

⑷或直接入氨银液5~10分钟。

氨银液：氨水2毫升加10%硝酸银水溶液，边加边摇荡至产生棕黄色 或黑色混浊液为止。

⑸迅速将切片入3%福尔马林液还原30~60秒至切片呈淡灰色，蒸馏水洗。

⑹0.2%氯化金水溶液调色至组织变为深灰色。

⑺5%硫代硫酸钠水溶液固定1~3分钟。

⑻入入1%明胶水溶液展平，贴于载玻片上，略晾干或用电风扇吹干。

⑼经95%酒精、无水酒精二次，无水酒精二甲苯等量混合液各1~3分钟。

⑽二甲苯透明三次，中性树胶封片。

石蜡切片：

组织块常规脱水，透明，包埋，切片厚15~20微米。

切片经二甲苯及各级酒精下行入水。以下步骤同冰冻切片。氨银液与3%福尔马林还原液用3~5张切片后，应换新液。用5%硝酸银水溶液，背景较清爽。

                                        2022.5.10  修改