免疫组化质量控制“三部曲”-诊断型免疫组化阳性对照的标准

诊断性免疫组织化学(dIHC)已经应用了几十年，其在诊断方面的应用不断扩大，最近又用于判断预后和预测药物疗效的生物标志物。然而，尽管在方法上取得了重大进展，但实践的标准化仍有待实现。为了确保运行dIHC标准化过程，特设专家委员会专门成立以解决控制的标准化问题。国际特设专家委员会分别在2014和2015年分别对诊断免疫组化阴性和阳性对照标准化问题进行了探讨，并且对诊断免疫组化对照的分类及标准定义、阴阳性对照结果判读及选择应用等方面提出专家推荐意见。

本文主要为了阐明阐明了IHC检测敏感性和特异性的定义，特别强调了这些定义如何适用于阳性对照，规定了关于dIHC阳性对照的“最佳实验室实践”建议。有关阴性对照的标准，请见：“”。

dIHC中必须设置阳性对照

使用阳性对照的目的：

1. 提供证据证明IHC检测方案的所有步骤均操作正确及成功，并达到预期灵敏度；

2. 阳性对照也证实了“正确的”抗体已被应用到适当的玻片；

3. 阳性对照可以监测之前优化和验证的IHC方案中的分析成分，并提供关于是否获得预期染色结果的重要信息。

4. 针对特定用途进行标准化的阳性对照，有助于染色方法从研究目的到诊断用途的转移；以及从一个实验室复制到另一个实验室；并有助于新检测方法的开发。

国际特设专家委员会推荐18种常见抗体对照组织及染色结果判断标准(中文版本的参考可见图后面的表格):

Pan-CK

低分子量角蛋白（CK8/18)

高分子量角蛋白（CK5/14)

CK20

CK7

Vimentin

TTF-1

CDX-2

CEA

CD31

SMA

Desmin

CD3

CD20

Ki67

S100

CgA

SYN

IHC检测对照的敏感性和特异性

1.正确选择阳性对照组织可提供有关技术敏感性的信息：

1）液基分析中，通过稀释含有已知数量的分析物(生物化学物质或分子)的对照样本对比对照校准曲线以确定技术灵敏度；

2）以细胞为基础的试验中，例如在组织切片上进行的免疫组化，技术敏感性通常由特定的组织成分(阳性对照)中“染色”反应的强度(从弱到强)来确定在具体蛋白表位上有已知蛋白表达。

3）一般诊断抗体：诊断的敏感性和特异性通常在病理学文献中给出。在特定的肿瘤类型中检测出特定的生物标志物的频率，这些报告给出“诊断”值仅作为一般建议，因为方法和病例人群都没有标准化，而且不同研究者的发现也会有所不同。

4）IHC染色的临床敏感性和特异性的确定需要与临床数据相关：

①通常适用于与临床结局或治疗应答相关的特定预后和/或预测的IHC抗体；

②这些更严格的IHC检测被CIQC(加拿大免疫组化质量控制程序http://www.ciqc.ca)称为II类免疫组化检测，对应于FDA (https://www.fda.gov/medical-devices/guidance-documents-medical-devices-and-radiation-emitting-products/guidance-submission-immunohistochemistry-applications-food-and-drug-administration-final-guidance)确定的II类和III类IVD批准程序；

③这些类型的检测必须标准化，否者不同实验室的设定的阈值也不相同；但这种信息显然无法在单个实验室内获得。如果是EQA组织提供足够数量的PT样本时，便可以确定病例群体的临床敏感性和特异性。

④当IHC应用于“个体化医疗”(预测性生物标志物或伴随诊断)时，灵敏度、技术、诊断和临床(以及特异性)甚至更重要，并且必须考虑进行实验室能力比对验证。

阳性对照标准化的原则和方法

1.阳性对照的最佳选择：需要掌握正常组织和病变细胞的知识，以及对免疫组化每项试验的预期用途有明确的定义；

2.在dIHC的绝大多数检测中，目的是证明特定靶抗原的存在或不存在;因此，这种检测主要是定性的。

ü如果dIHC检测的预期用途是基于目标抗原的低水平和高水平的证明和区分，那么必须通过适当选择反映表达范围的阳性对照来监测技术校准和诊断使用。

ü即使采用IHC作为染色剂，在定性方面，它仍然具有定量成分，因为下限必须在适当的诊断环境中定义(如果不可能的话，必须是描述性的)。

üPT的多个EQA项目已经启动了阳性质控品的标准化，但仍有必要对阳性质控品的选择、设计和解读提供'最佳实践'建议，以供临床实验室普遍使用。

3.在个体化医疗中，IHC检测“预测性生物标志物”或“伴随诊断”的应用迅速增加，这对提高IHC检测的准确性和一致性提出了要求。

ü因此，正确选择和解释阳性控制结果的必要性变得更加明显。

阳性对照在诊断免疫组化中的循证使用

我们怎么知道免疫组化方法显示出在不同表达水平下展示目标抗原所需的能力?

以下建议是基于以下几点:

1.已发表的文献;

2.在各种室间质量评价计划中产生的证据;

3.以及国际特设专家委员会成员目前的协商一致意见。

外部阳性对照设计的主要原则

相同的组织处理

1.如前所述，样品制备(冷缺血时间)和固定(类型和总时间)应尽可能标准化。

2.理想情况下，时间点应该记录整个测试的所有步骤，并建立可接受的范围。

3.最关键的因素与缺血时间、固定、脱钙和未染色切片有关，包括切片厚度和对照切片的保存条件(如果预先切取)。

4.组织处理参数也可能很重要(标准与快速组织处理等)，与准备和固定相关的参数包括:

①缺血时间;

②放置于固定物中的组织块的厚度;

③固定剂类型;

④固定总时间;

⑤固定温度。

⑥大多数外科病理标本在10%福尔马林缓冲液(pH = 6.9, 37%甲醛、一碱基和二碱基磷酸钠和蒸馏水的溶液)中接收。

5.对于需要脱钙的样品，额外的参数可能会影响最终染色的强度，因此在设计对照时必须考虑:

①脱钙前的固定时间；

②脱钙剂类型；

③脱钙时间;

④脱钙温度。

⑤此外，如果实验室采用>1法脱钙，则每种脱钙方法应选择单独的外阳性对照

6.作为细胞块制备的细胞学样本可能包括其他参数，

①预先固定样品稳定(例如，cytoolyt);

②聚合试剂的类型;

③放置确定性固定的时间。

7.存档的诊断组织(病理档案中的石蜡块)通常已广泛获得，目前大多数临床实验室使用它进行阳性对照。

①在许多方面，存档的诊断组织不是外部阳性对照的最佳来源，因为在绝大多数情况下，没有记录确切的分析前条件，并且未知。

②存档的诊断组织是向患者提供的全部治疗的医院记录的一部分，应注意保存未来可能具有诊断意义的材料。

8.由于在常规临床实践中识别足够数量的合格组织越来越具有挑战性，因此细胞系块、异种移植物或组织样组织可能在未来得到越来越多的应用。

技术灵敏度及校正

原则上，dIHC阳性对照的最佳技术灵敏度实际上是指根据临床相关经验，在特定的低水平抗原表达下定义的检测下限。如上所述，扁桃体或阑尾的淋巴滤泡为建立HE、LE和NE的许多标志物提供了一个很好的例子。

免疫组织化学关键分析性能对照(iCAPCs)

1.iCAPCs本质上是人类阳性对照组织，已根据公认的标准进行了良好的特征鉴定，并已显示在特定条件下，特定蛋白(抗原/表位)的可预测水平和表达模式以及细胞定位。

2.建议iCAPCs应成为方案开发、日常组织对照和EQA PT样品设计中对照选择的关键组成部分(图19、20)。iCAPCs的优化识别和使用是实现IHC诊断一致性的第一步，有望提高IHC检测结果的标准化。

3.为了达到有用的标准化水平，iCAPCs可能成为每个特定dIHC检测的外部阳性对照的“金标准”。显然，iCAPCs的成功使用是基于样品制备和固定满足可接受的标准。

4.当一系列iCAPCs被建立并被接受为主要的标准化外部阳性对照时，这些iCAPCs也可以用于校准/验证其他类型的外部阳性对照，即所谓的次要对照，包括来自存档诊断组织(如各种肿瘤)的不同组织样本，以及细胞系制剂、异种移植物或组织样。

5.次要类型的外部阳性对照可能包括:

①各类组织:

(i)前瞻性或回顾性收集患者样本(各种肿瘤或其他不属于iCAPCs的组织);

(ii)市售组织样本;

(ii)异种移植;

(iv)组织瘤。

②各类细胞制剂:

(i)从患者的积液或其他细胞学样本制备的细胞块;

(ii)从细胞系(单个或混合细胞系)制备的细胞块;

(iii)细胞系或患者样本制备的细胞学片。

③肽。

iCAPCs和新步骤开发

1.为此目的选择的对照组织将尽可能多地代表已知变量。

2.为了解决方案的稳健性，或者在实验室中应用不同的分析前参数时，方案开发的测试设计最佳包括不同固定时间的样品，从2小时(固定下)到168小时(长期固定)，以及脱钙组织(包括实验室中使用的所有类型的脱钙方案)。

3.理想情况下，如果使用不同的固定物，建议所有的固定物都包括在上面的大范围固定时间内。当组织处理发生显著变化时(如新型组织处理器、以CO₂为基础的组织处理、运输条件改变如引入真空密封等)，推荐使用上述原则/建议制定一种新的TMA用于方案制定。虽然TMA块包括iCAPs和具有不同分析前条件的组织被推荐用于新方案的开发，但目前这种方法并不能取代关于完整方案验证的国家和国际建议，这些建议应该在存在的地方遵循。

I类与II类IHC检测及“适合使用”原则

1.加拿大病理学家协会国家标准委员会1.(Canadian Association of Pathologists National Standards Committee)和加拿大免疫组织化学质量控制(Canadian Immunohistochemistry Quality Control)也引入了基于预期用途的I类和II类IHC检测的概念。

2.I类IHC检测结果由病理学家在形态学和其他相关实验室或临床信息的背景下解读和使用。

3.II免疫组化检测包括:

1)用于指导患者治疗的检测(如乳腺癌的ER和PR或胃癌的HER2);

2)基本确定诊断(如淋巴瘤中的ALK或GIST中的DOG1);

3)或筛查肿瘤样本，以确定是否需要对靶向治疗进行额外检测(如在肺癌ALK FISH前进行ALK IHC筛查)或基因检测(如结肠癌或子宫内膜癌的MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 IHC)。

4.同样，在选择对照时应使用“适合使用”原则。

（例如，恶性淋巴瘤的ALK检测通常采用来自已知ALK表达的恶性淋巴瘤的阳性对照组织。然而，这种对照可能不适用于肺癌的ALK检测，因为其表达水平可能要低得多。适当时，内部阳性对照可能是II类检测的理想方法。）

阳性对照结果的解读

作为日常质量控制的一部分，技术人员的职责通常包括解释外部阴性和阳性对照的结果，以确保在切片发布给病理学家之前正确执行IHC方案。

尽管临床实践各不相同，但强烈建议病理学家解读所有阳性对照的结果，将其作为解读和报告IHC染色结果的一个组成部分，并且永远不应在未参考对照的情况下判读预测性标志物。

参考文献：

1. Standardization of Positive Controls in Diagnostic Immunohistochemistry: Recommendations From the International Ad Hoc Expert Committee[Appl Immunohistochem Mol Morphol 2015;23:1–18).]

2. 国际特设专家委员会建议:诊断免疫组化阳性对照标准化[临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2016 Jan；321) ]