孟祥文，贾晓益，陆志远，程芷洛，谭亚楠，张敏
1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.中国科学技术大学附属第一医院，安徽 合肥 230001
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种免疫系统攻击全身健康细胞和组织的疾病，免疫系统激活的特点是B细胞和T细胞反应过度，对自身抗原的免疫耐受性丧失。抗体产生和缺陷清除、免疫复合物循环和组织沉积、补体和细胞因子激活，都会导致从轻度疲劳和关节疼痛到危及肾脏、中枢神经、血液、心脏、角膜等多个器官组织的多种临床表现[1-2]，诊断难度较大[3]。目前西医治疗主要采用非甾体抗炎药、抗疟药、糖皮质激素和免疫抑制剂，往往带来较严重的不良反应[4-5]。
根据临床表现，SLE可归属中医学“阴阳毒”“红蝴蝶斑”“温毒发斑”等范畴，五脏六腑均可发生病变，终末期肝肾损害尤为明显。近年来，中医药在SLE治疗中发挥着重要作用。目前大多认为其发病基础是先天禀赋不足，故治疗以补其不足为主。六味地黄丸由熟地黄、山药、山萸肉、牡丹皮、茯苓、泽泻组成，临床用于治疗多种疾病，研究表明其在抗氧化、抗衰老、增强免疫、降血压、降血脂、降血糖等方面疗效显著[6-7]。六味地黄丸临床用于辅助治疗SLE可提高疗效，降低毒性反应[8-11]，但其具体作用机制尚不明确。本研究采用网络药理学和分子对接技术探究六味地黄丸治疗SLE的作用机制，并对其核心靶点进行深入分析，为相关研究提供参考。
通过TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/index.php），分别以熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓为检索词，获取六味地黄丸组方药物活性成分，以口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选。通过SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、 本 草 组 鉴（HERB，http://herb.ac.cn/）数据库预测活性成分靶点，SwissTargetPrediction数据库选择分数>0.1者，结果取并集，作为六味地黄丸作用靶点。
从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获得基因芯片GSE49454，利用R软件limma包进行差异分析，以校正后P<0.05且|logFC|≥0.4为条件筛选差异表达基因，利用R软件VennDiagram包绘制六味地黄丸靶点基因与SLE差异表达基因的韦恩图。
将药物活性成分、交集靶点及相关通路导入Cytoscape3.8.2软件，构建成分-靶点-通路可视化网络。图中节点（node）分别为成分、靶点、通路，边（edge）表示各节点间的相互关系。利用插件CytoNCA分析该网络，以获取六味地黄丸治疗SLE的核心成分。
将交集靶点基因输入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），物种限定为“Homo sapiens”，设置置信度>0.4，同时隐藏离散靶点，得到蛋白相互作用（PPI）网络。利用Cytoscape3.8.2软件对PPI网络进行可视化，并用插件cytoHubba筛选核心靶点基因。
利用R软件提取数据集中SLE疾病活动度（DAI）评分数据，参考SLE诊疗指南[12]，按照SLEDAI评分将SLE分为轻度活动（SLEDAI≤6，Light active）和中重度活动（SLEDAI>6，Moderate to severe activity），提取出核心靶点基因在正常和SLE不同分期中的表达数据，并绘制小提琴图。
将药物活性成分与核心靶点基因进行分子对接。利用ChemBio3D Ultra 14.0将所得活性成分的mol2格式文件转化为3D结构。利用PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取核心靶点基因的PDB格式文件，利用PyMOL2.4.1软件对蛋白质进行去水、加氢操作，再通过AutoDock Vina 1.1.2软件对药物活性成分与核心靶点基因进行分子对接。
利用TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/）数据库分析核心靶点基因调控的相关转录因子，通过Cytoscape3.8.2软件构建基因-转录因子网络。
利用R软件提取数据集中免疫细胞相关数据，进行核心基因与免疫细胞的相关分析。
通过TCMSP共筛选得到六味地黄丸活性成分69个，其中熟地黄2个、山茱萸20个、山药16个、泽泻10个、牡丹皮11个、茯苓15个，其中谷甾醇和豆甾醇为重复成分。利用SwissTargetPrediction和HERB数据库得到活性成分作用靶点813个。
利用R软件的limma包进行数据集GSE49454的差异分析，共得到703个差异基因，其中上调基因442个、下调基因261个（见图1A）。药物靶点与差异基因的共同靶点基因共41个，作为六味地黄丸治疗SLE的潜在作用靶点（见图1B）。41个靶点基因中，上调靶点基因31个、下调靶点基因10个（见图1C）。靶点基因在各样本中的表达情况见图1D。
其中，ΔN(k,h)为与4个空气弹簧状态有关的偏差载荷，可通过调节空气弹簧高度调整阀进行调节，当调整至零时即为载荷最平均分配状态。
图1 六味地黄丸治疗SLE靶点基因分析
41个交集靶点基因GO和KEGG通路富集分析，以P<0.05为条件得到BP条目955个、CC条目30个和MF条目106个，各取前10个条目，见图2A。BP主要富集在脂多糖反应、细菌来源分子反应、活性氧代谢过程、细胞因子产生正调控、活性氧代谢过程正调控等；CC主要富集在分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、囊泡腔、质膜外侧、特定颗粒管腔；MF主要富集在细胞因子受体结合、肝素结合、肿瘤坏死因子受体结合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、糖胺聚糖结合。根据P<0.05筛选出53条KEGG通路，前10条通路见图2B。KEGG通路主要富集在甲型流感、弓形体病、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染、NOD样受体信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成等。
图2 六味地黄丸治疗SLE靶点基因GO和KEGG通路富集分析
利用Cytoscape3.8.2软件对六味地黄丸治疗SLE的活性成分、交集靶点及相关通路构建可视化网络，活性成分-靶点-通路网络见图3（图中编号对应的活性成分见本文OSID码）。利用CytoNCA插件对该网络中的节点进行度值分析，结果度值>9的活性成分分别为槲皮素、山柰酚、海风藤酮、玉兰脂素B和羟基芫花素，其度值分别为18、12、10、10、10。这些成分可能在六味地黄丸治疗SLE中发挥重要作用，故作为核心成分。
图3 六味地黄丸治疗SLE活性成分-靶点-通路网络
将41个交集靶点导入STRING平台，构建PPI网络，见图4。网络中包含38个节点、116条边。利用cytoHubba插件进行分析，按度值降序排列，将前5位靶点基因作为核心靶点基因，分别为TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10、MPO。
图4 六味地黄丸治疗SLE靶点PPI网络及核心靶点基因
提取数据集中的SLEDAI评分数据，按SLEDAI评分对SLE样本进行划分，核心靶点基因在正常、非活动期、活动期的表达情况见图5。正常与SLE患者比较，TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10和MPO表达均有显著差异；非活动期与活动期比较，PTPRC表达存在显著差异。
图5 六味地黄丸治疗SLE核心靶点基因在不同时期表达的小提琴图
通过分子对接分析核心靶点与核心成分的对接能力，结合能<-1.2 kcal/mol认为具有对接能力。5个核心成分（槲皮素、山柰酚、海风藤酮、玉兰脂素B、羟基芫花素）与5个核心靶点（TLR4、CCL2、PTPRC、CXCL10、MPO）分子对接结果见表1，各成分与靶点均有较好的亲和力。槲皮素与靶点对接模式见图6。
图6 六味地黄丸治疗SLE主要核心成分与核心靶点分子对接模式
表1 六味地黄丸核心成分与核心靶点分子对接结合能（kcal/mol）
为探究核心靶点基因的下游调节机制，对靶点基因的转录因子进行分析，结果有4个核心靶点基因与6个转录因子有相关作用（见图7A），其中转录因子SPI1、STAT1和NFKB1表达量有显著差异（见图7B）。
图7 六味地黄丸治疗SLE核心靶点基因-转录因子网络与转录因子表达
提取SLE患者免疫细胞相关数据，将SLE患者按核心基因分为高表达组和低表达组，分析不同组间的免疫细胞数量差异。结果显示，TLR4表达与CD4+T细胞、中性粒细胞、CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞和B细胞数量变化相关，CCL2表达与中性粒细胞数量变化相关，CXCL10表达与中性粒细胞、血小板和NK细胞数量变化相关，MPO表达与中性粒细胞和NK细胞数量变化相关，见图8。
图8 六味地黄丸治疗SLE核心靶点基因免疫浸润分析
本研究采用生物信息学与网络药理学方法探讨具有作用多靶点、多通路的复杂中药复方六味地黄丸与SLE之间的关系。基于成分-靶点-通路网络，发现六味地黄丸抗SLE的主要活性成分为槲皮素和山柰酚。槲皮素是有效的抗氧化剂和抗炎分子[13]，可有效保护SLE小鼠肾脏功能，改善其免疫功能，其可能机制是下调转化生长因子-β1、单核细胞趋化蛋白-1表达[14]。Li等[15]研究表明，槲皮素可以防止SLE模型小鼠狼疮肾炎的发生，并降低免疫细胞活化。山柰酚对炎性疾病如SLE和类风湿关节炎均有明确的治疗效果[16]。这表明六味地黄丸治疗SLE的过程中发挥重要作用的可能是其中的黄酮类化合物。
KEGG通路富集分析结果发现，NOD样受体信号通路与核心靶点密切相关。NOD样受体即NLRs家族，有研究发现，SLE患者PBMC中NLRP3/NLRP1炎性小体的表达显著下调[17]。油橄榄苦苷及其酰基衍生物可通过NLRP3途径改善SLE小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应[18]。褪黑激素通过抑制NLRP3炎症信号通路的激活，可恢复氧化应激和炎症的形态学和衰减，从而减弱由前列腺素诱导的狼疮肾炎[19]。Yu等[20]发现细菌暴露增加了单核细胞中NOD2表达，从而导致外周血单个核细胞产生促炎细胞因子，加重SLE病情。
通过构建PPI网络，运用cytoHubba插件筛选出六味地黄丸治疗SLE的核心靶点基因TLR4、CCL2、CXCL10、MPO和PTPRC，这些靶点基因与SLE关系密切。MicroRNA16可与DEC2直接结合，抑制TLR4信号通路，抑制狼疮性肾炎肾组织增生和系膜细胞增殖。CCL2是治疗SLE的重要靶点[21]。维生素D可通过降低CXCL10在SLE中的表达，改善内皮功能障碍，恢复髓系血管生成细胞功能[22]。泛素化MPO对SLE患者CD4+T淋巴细胞再激活有不同程度的诱导作用[23]。有研究表明，SLE患者中PTPRC含量明显低于健康对照[24]。本研究通过对核心靶点基因的免疫分析发现，这些基因与诸多免疫细胞相关联。TLR4在先天免疫中起着基本作用并介导产生有效免疫所必需的细胞因子。CCL2和CCL7的抗体中和可显著降低脂多糖诱导的总白细胞和中性粒细胞积累[25]。EZH2通过抑制CXCL10表达抑制NK细胞介导的抗肿瘤免疫[26]。MPO与中性粒细胞关系密切。PTPRC编码的PTP蛋白是T细胞和B细胞抗原受体信号转导的重要调节因子。提示上述核心靶点基因与免疫系统密切相关。核心靶点基因和转录因子关联分析中SPI1、STAT1和NFKB1表达差异有统计学意义，表明六味地黄丸可能通过作用于核心靶点引起下游转录因子的变化，进而调控免疫细胞的功能，发挥治疗SLE的作用。
综上，本研究表明六味地黄丸通过多成分、多靶点、多通路治疗SLE，可为相关研究提供思路与理论基础，后续仍需进一步进行实验验证。
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