数字PCR精准定量AAV在基因治疗中的应用
作者：David Dobnik
基因治疗正在成为许多遗传病的的潜在治疗方法。在美国有近400项基因治疗正在进行临床试验，用于治疗血友病和脊髓性肌萎缩症等疾病 ⁽¹⁾。目前用于向患者细胞提供此类治疗的主要载体是病毒载体，如腺相关病毒 (AAV)，但生产有活性的用于基因治疗的载体是非常困难的，其中一个难点就是生产准确浓度的载体以产生安全有效的治疗。
一般来说，基于AVV的基因疗法需要高浓度的病毒载体才能有效。这是因为此类治疗通常需要在身体较小区域（例如中枢神经系统）中以小剂量进行给药⁽²⁾。不幸的是，如果AAV 浓度过高，AAV 衣壳蛋白本身可能会引发免疫反应，导致载体分解并使治疗无效⁽³ ⁴⁾。由于许多患者可能在其一生中的某个时候接触过AAV，因此高浓度AAV的治疗可能会引发免疫反应 ⁽⁴ ⁵⁾。因此，AAV开发人员必须精确地定量AAV浓度，以使用最低剂量来最大限度地提高疗效并最大限度地减少副作用。
AAV开发人员面临的挑战
AAV是基因治疗最常见的载体之一，由于低免疫原性和不会整合到基因组的特性，这两者都有助于最大限度地降低突变风险⁽⁶⁾。不幸的是，复杂的 AAV 载体生产过程会限制开发人员控制批次最终浓度的能力。该过程首先将所需的治疗序列插入病毒并使用转染的宿主细胞产生载体。然后，开发人员裂解宿主细胞，提取病毒颗粒，并对其进行纯化，以消除宿主细胞污染物并最大限度地减少缺少治疗序列的 AAV 病毒粒子。预测最终产品中的 AAV 浓度可能很困难，尤其是随着工艺规模扩大到更大的生物反应器。为大规模生产建立优化流程是当今AAV开发人员面临的主要挑战之一。
通常，上游处理的粗提物中AAV浓度可以高达2× 10¹¹ /mL，但还不足以用于临床⁽³⁾。针对肝脏的基因疗法（如血友病B）必须以10¹²/公斤体重的浓度提供给患者。针对中枢神经系统治疗脊髓性肌肉萎缩症等疾病的疗法必须以更高的剂量给药：10¹⁴/公斤体重。为了以合理的体积提供有效剂量，药物必须浓缩 100-10000倍⁽³⁾。因此，开发人员必须在纯化和浓缩步骤后测量病毒滴度，以确保达到最终产品的正确剂量。为此，AAV开发人员需要可靠的测试方法。然而不幸的是，很少有针对AAV纯度和安全性的标准。因此，AAV开发人员必须设计自己的测试方法。
为了准确定量病毒滴度，开发人员需要一种可以精确测量AAV载体基因组的工具。定量 AAV 滴度的常用方法是定量聚合酶链反应 (qPCR)，但该方法不够精确，无法保证安全有效疗法的开发。这是因为qPCR使用的是模拟信号：qPCR技术通过测量达到某个荧光阈值所需的扩增循环次数来测量核酸浓度，使用标准曲线将所得数字转换为浓度。但实际上很难得到准确的标准曲线，因为该过程受人为因素影响很大，最终增加了测量的不确定性。使用标准曲线可能导致滴度定量不准确，具体取决于用于制备参考DNA 的方法，并且可能导致病毒滴度的高估⁽⁷⁾。事实上，qPCR结果的差异可能高达二倍⁽⁸⁾。
图 1：qPCR（左）产生模拟信号输出，通过标准曲线转化为 DNA 浓度。液滴数字 PCR (ddPCR) 技术（右）对反应混合物进行分区，并提供数字二进制信号，指示每个分区中是否存在 DNA。
使用液滴数字PCR测量AAV滴度
液滴数字PCR (ddPCR)技术已被证明是测量AAV滴度的可靠且稳健的工具⁽⁹⁾。与使用相对方法测量大量样本中AAV浓度的qPCR不同，ddPCR使用分区技术和泊松统计提供AAV基因组的绝对定量（图1）。首先，研究人员首先将 20μL的反应混合物加载到芯片上，然后样本制备仪将反应混合物分成10万个均匀的液滴。每个液滴包含零个、一个或几个核酸链，并充当其自己的反应容器，在其中发生单独的PCR反应。这些反应中使用的引物来自AAV载体的特异性序列。因此，扩增只会发生在含有来自该载体的DNA的液滴中。随着DNA 扩增，序列特异性探针被切割，并且在含有目标序列的液滴中产生荧光信号。在缺少目标序列的液滴中，报告染料不会发出强信号。放大完成后，生物芯片分析仪将液滴一个接一个地流过检测器，分析仪计算荧光和非荧光液滴的数量。使用泊松统计，可以计算原始样本中AAV DNA的浓度。与qPCR相比，ddPCR不依赖于标准曲线。相反，它直接读出目标分子数量的绝对计数。ddPCR技术对影响扩增速率的污染物也更有抵抗力，因为它不依赖扩增效率来量化核酸。
ddPCR方法学实践
采用更精确、更灵敏和更强大的工具来定量病毒滴度并不是AAV开发者所独有的。生物学中的几个例子证明了ddPCR技术发挥这一作用的潜力。例如，我和我在斯洛文尼亚卢布尔雅那国家生物学研究所的团队测试了ddPCR技术在量化马铃薯植物中马铃薯病毒Y (PVY) 变体方面的性能 ⁽¹⁰⁾。PVY有许多不同的亚型，每个亚型可能会因引物和探针错配而存在非特异扩增，因此很难制定一个标准曲线以确保每个亚型的都能准确定量。由于ddPCR不依赖循环阈值来定量核酸，我们想确定该方法是否可以可靠地量化病毒。事实上，我们发现ddPCR在检测某些PVY变体时比qPCR灵敏一个数量级。此外，ddPCR表现出很宽的动态范围，仅受分析的液滴数量限制。我们发现三种不同的qPCR检测揭示了三种不同的病毒计数，我们无法确定正确的计数，直到我们使用ddPCR进行检测才解决了这个问题。这些数据不仅证明了ddPCR技术的灵敏度和动态范围，而且还展示了如何使用它来解决qPCR产生的不确定性。在2016 年将我们的ddPCR专业知识转移到基因治疗领域，发现这种敏感性也适用于 AAV滴度定量。在另一实验室的一项研究中，ddPCR 方法在单链 AAV 载体基因组定量方面的灵敏度是qPCR的四倍⁽¹¹⁾。在我的实验室中，我们发现为此目的，ddPCR比qPCR更稳健、更精确。具体来说，在我们对AAV病毒滴度⁽⁸⁾的广泛检查中，我们使用ddPCR和qPCR 测试了来自下游纯化过程几个步骤的样本，发现ddPCR产生的变异系数显著降低。在同一项研究中，ddPCR结果帮助我们改进下游生物处理工艺流程：该技术能检测到游离的DNA，在用DNA酶处理后其数值显著降低，从而证明了此类预处理的重要性。如此高的灵敏度和稳健性可以提高工作流程的有效性并使基因治疗更安全。了解批次的AAV浓度使开发人员能够预测基因治疗的效力并确定患者的正确剂量
进一步优化检测技术
定量AAV 病毒滴度的另一个问题是可能将含有基因片段的 AAV 衣壳误认为是功能齐全的载体。这可能会导致高估病毒滴度和产生低效力的治疗。众所周知，病毒基因组浓度和具有感染性基因组浓度可能不同⁽¹² ¹³⁾，需要更多的研究来确定为什么这两种浓度不完全相关。另一个挑战是，通过单重测试，无法确定是否存在完整基因，或者探针是否与恰好包含部分基因的DNA片段结合。未来，我们计划开发更高的多重分析—超越已经报道的双重分析⁽⁹⁾。这将增加使用ddPCR技术定量完整和具有感染性载体基因组的可能性。这些数据可以帮助我们了解是什么使 AAV 有效，并帮助我们开发更安全、更有效的基因疗法。
基因疗法的未来
在小分子药物开发中，精准定量从来没有像在基因治疗中那样受到关注。基因疗法采用的生物活性物质在其制造过程中产生了不确定性。需要给予正确的剂量，因此 AAV 生物制造商必须始终如一地监测AAV 病毒滴度。由于潜力巨大，基因治疗开发人员必须重新集中精力改进其工艺流程，以确保这些疗法与传统疗法一样安全有效。通过适当的监管、标准化和质量控制，基因治疗厂家可以最大限度地减少其过程中的不确定性，并建立基因治疗管线，为数百万患者提供安全、有效、创新的治疗方法。对于这些患者来说，基因治疗可能是他们改善健康的唯一希望。
参考文献
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