软骨是以支持作用为主的结缔组织。软骨内不含血管和淋巴管,软骨组织由软骨细胞和软骨基质构成, 软骨基质是软骨细胞的细胞外基质,根据软骨基质内含纤维的不同,可将软骨组织分为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨3种。
透明软骨分布较广,主要分布于关节软骨、肋软骨等。软骨基质由无定形基质和包埋在基质内的胶原原纤维构成,无定型基质中主要含3种糖胺聚糖:聚透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素。透明软骨中的纤维是由II型胶原蛋白组成的胶原原纤维,含量约占软骨干重的40%,此外,在基质中还含有少量其他胶原蛋白,如VI、IX、X、XI型胶原。软骨基质中的小腔为软骨陷窝,软骨细胞即位于此陷窝内,软骨细胞周基质中含VI型胶原蛋白组成的细网丝。
纤维软骨分布于椎间盘、关节盘及耻骨联合等处。基质内富含胶原纤维束,呈平行或交错排列,化学成分为I型胶原蛋白,也含不等量II型胶原原纤维,无定型基质很少,其中以多功能蛋白聚糖为主。软骨细胞较小而少,成行排列于胶原纤维束之间。
弹性软骨分布于耳廓及会厌等处。结构类似透明软骨,仅在间质中含有大量交织成网的弹性纤维,胶原纤维较少,具有较强弹性。
综上,软骨基质中主要为胶原蛋白,因此,解离过程中,选择胶原酶进行解离。胶原酶提供广泛的蛋白水解活性,能够降解天然胶原和网状纤维,且优先切割细胞膜外的蛋白,基本上可保持细胞完整。
在标准培养基中配制胶原酶溶液 (1mg/mL),使其溶解并通过0.45μm和0.2μm注射器过滤器进行无菌过滤。0.45μm过滤步骤对于实现高效过滤至关重要。
胶原酶混合物可以新鲜使用或立即冷冻,制备后最多可使用6个月。分装储存,因为冻融循环会失去活性。
在PBS中晃动1 min,清洗切割的软骨组织,并重复几次洗涤步骤。
将切骨的软骨组织放在培养皿上,并使用干净的手术刀从软骨表面刮掉残留的血液或非软骨组织。
沿骨头平切,从骨头表面去除软骨片,放入培养皿标准培养基中。使用手术刀将软骨片(浸在培养基中)切成约 3 mm×3 mm厚度的小块。
将软骨碎块转移至50 mL管中,管中加入胶原酶消化混合物(10 % v/v 软骨:消化混合物),在37°C振荡(45-60 rpm)孵育软骨-胶原酶混合物12-15 h。
消化完成后,将离心管至于冰上,将混合物通过70 μm细胞筛过滤。并用预冷培养基清洗滤网。
300g ,4℃离心5 min。
使用预冷的培养基洗涤沉淀,重悬,并重复离心步骤。
在1mL预冷的缓冲液中重悬细胞,直至沉淀完全重悬。并通过移液吹打彻底混合。
质检,计数细胞并使用台盼蓝检验细胞活力。
如有较多红细胞,则需再做裂解红细胞处理:
重悬细胞沉淀,加入2 mL红细胞裂解液,室温下裂解2 min,以去除剩余红细胞。
加入10 mL预冷的缓冲液抑制红细胞裂解液的活性。
4℃,500g下离心5 min。
重悬于1 mL预冷的缓冲液中并计数,使用台盼蓝评估细胞活力并计数。
质检合格后,稀释到适当浓度,进行上机。
所获细胞悬液:活率大于97 %,结团率低,背景干净。
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