scRNA-seq揭示STZ诱导的1型糖尿病小鼠骨髓与骨质疏松的关系

前言

题目：Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ-induced type 1 diabetic mice
日期：2022-01-21
期刊：Journal of Advanced Research
链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123222000200

摘要

1 型糖尿病 (T1D) 的特征是慢性胰岛素缺乏和由于对胰腺 β 细胞的自身免疫攻击而导致的高血糖症。T1D 发病高峰期为 0 至 14 岁，但症状性发病没有年龄限制 。由于TID的症状和并发症严重，对其发病机制和相关并发症的预防越来越受到重视。目前关于 T1D 的遗传学、流行病学和临床管理的知识已经比较全面，但对 T1D 期间骨髓中的细胞种类的了解仍然有限。作者收集健康（C组）和STZ诱导的T1D小鼠（D组）股骨和胫骨的全骨髓细胞进行单细胞RNA测序分析，首次揭示了 STZ 诱导的 T1D 小鼠骨髓免疫细胞的分布和异质性。BM-中性粒细胞/B淋巴细胞的比例与STZ诱导的T1D小鼠骨质减少呈负相关，这可能会加强对治疗T1D和预防T1D诱导的骨质减少的认识。

健康和 STZ 诱导的 T1D 小鼠的骨髓细胞谱

从健康（C组）和STZ诱导的T1D小鼠（D组）的股骨和胫骨中收集了全骨髓细胞。在消化和红细胞溶解后，收集来自 C 组的 12,279 个细胞和来自 D 组的 15,118 个细胞用于单细胞 RNA-seq 分析。

聚类分群得到12个clusters，注释的细胞类型包括：

• 中性粒细胞（主要表达 Cxcr2、Ly6g 和 Ltf）
• 单核细胞（主要表达 Fn1、Ccr2 和 F13a1）
• 中性粒细胞-骨髓祖细胞（NMP，主要表达 Elane、Mpo 和 Prtn3）
• T 淋巴细胞（主要表达 Cd3d、Ccl5 和 Ms4a4b）
• B 淋巴细胞（主要表达 Cd79a、Cd19、和 Ighm）
• 树突状细胞（DC，主要表达 Siglech、Irf8 和 Bst2）
• 红细胞（主要表达 Hba-a1、Hbb-bs 和 Hbb-bt）
• 造血干细胞（HSC，主要表达 Cd34、Adgrg1 和Cdk6）
• 巨噬细胞（主要表达C1qa、Vcam1和Mrc1）
• 嗜碱性粒细胞（主要表达Cd200r3、Mcpt8和Prss34）
• 浆细胞（主要表达Jchain、Iglc2和Mzb1）
• 间充质干细胞（MSC，主要表达Cxcl12 、Col1a2 和 Lepr）

之后看了不同细胞类型的比例变化。CD45被称为常见的白细胞抗原，由所有免疫细胞表达。CD45 +免疫细胞占C组细胞的95.44%，占D组细胞的96.33%。不过，以下这些细胞簇的比例有所增加：BM-中性粒细胞从 46.94% 增加到 64.04%；NMP从3.47%提高到6.48%；血浆和T淋巴细胞略有增加。另一方面，以下这些细胞簇的比例有所下降：B 淋巴细胞从 18.12% 急剧下降到 3.34%；DCs 从 4.00% 显著下降到 0.58%；巨噬细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞略有减少。在上述所有免疫细胞中，BM-中性粒细胞团的比例增加最为显著，而B淋巴细胞细胞团的比例减少最为显著。

STZ诱导的T1D小鼠骨髓中BM-中性粒细胞的异质性

之前看到，BM-中性粒细胞在 D 组的所有免疫细胞中呈现出最大的比例增加。之后又分析了 BM-中性粒细胞亚群的特征。BM-中性粒细胞可继续分为 6 个亚群：

• BM-neutrophil_1（主要表达 Asprv1、Prok2 和 Fbxl5）
• BM-neutrophil_2（主要表达 Ltf、Zmpste24 和 Cybb）
• BM-neutrophil_3（主要表达Clec4d、Thbs1、Egr1）
• BM-neutrophil_4（主要表达Ube2c、Mki67、Top2a）
• BM-neutrophil_5（主要表达Pcna、Rrm2、Pclaf）
• BM-neutrophil_6（主要表达Actb、CT010467.1 和 Tmsb4x）

各亚群的比例变化如下：BM-neutrophil_1增加最多，从5.97%飙升至50.14%；BM-neutrophil_2 从 34.4% 降至 19.12%；BM-neutrophil_3 从 38.53% 降至 3.13%；BM-neutrophil_4 从 16.22% 降至 15.33%；BM-neutrophil_5 从 4.2% 微升至 5.67%；BM-neutrophil_6 从 0.68% 略微增加到 6.61%。与C组相比，BM-neutrophil_1的比例显著增加。相反，BM-neutrophil_3 的比例下降最为显著。

此外，免疫组织化学染色验证了 D 组中 BM-中性粒细胞（以 CXCR2 标记）的增加。

接下来，使用 Monocle 对 BM 中性粒细胞的 6 个亚群进行拟时序分析。结果表明有两种不同的细胞命运：

• 一种从 BM-neutrophil_4 和 BM-neutrophil_5 开始，向 BM-neutrophil_1 或 BM-neutrophil_3 分化，
• 另一种从 BM-neutrophil_2 和 BM-neutrophil_6 开始，向 BM-neutrophil_1 或 BM-neutrophil_3分化。

此外，由于BM-neutrophil_1在D组细胞中所占比例最高，因此对BM-neutrophil_1中上调的DEG进行GO富集分析和KEGG通路分析。结果表明，BM-中性粒细胞_1中DEGs中富集的大多数生物学过程与己糖代谢过程、葡萄糖代谢、合成代谢和细胞因子介导的信号通路有关。KEGG通路分析表明，骨细胞分化、IL-17信号通路和TNF信号通路是DEG中最富集的通路。

STZ诱导的T1D小鼠骨髓中B淋巴细胞的异质性

接下来继续看 B 淋巴细胞的特征，B 淋巴细胞可以分为两个亚群，前体 B 细胞 (Pre_B) 和 Naïve_B 细胞 (Naïve_B)。D 组中仅存在 Naïve_B 亚群，Pre_B占据C组的大部分。

RNA 速度分析表明 Pre_B 子集的产生早于 Naïve_B 子集。

对 B 细胞中上调的 DEG 进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析。GO富集分析表明，大多数富集的生物学过程包括：抗原加工、通过MHC II类呈递肽抗原、通过MHC II类抗原加工和呈递肽或多糖抗原以及淋巴细胞增殖。富集的细胞成分主要包括 MHC 蛋白复合物和溶酶体。KEGG通路分析表明，DEGs主要富集于免疫相关疾病，包括结核病和哮喘、抗原加工和呈递以及造血细胞谱系。

STZ 诱导的 T1D 小鼠骨髓中单核细胞、T 淋巴细胞和 DCs 的异质性

分析了单核细胞、T 淋巴细胞和 DC的亚群

单核细胞分为5个亚群，包括：

• 经典单核细胞（主要表达Fn1、Tmsb10和Crip1）
• 中性粒细胞（主要表达Retnlg、Ngp和Camp）
• NMP（主要表达Mpo、Prtn3和Ncl）
• 非经典单核细胞（主要表达Ace、Cd36 和 Apoe）
• 巨噬细胞（主要表达 Cd74、H2-Aa 和 H2-Ab1）

各亚群的比例变化如下：经典单核细胞从71.09%下降到60.75%；中性粒细胞从 15.39% 增加到 27.85%；NMP从5.46%提高到7.66%；经典非经典单核细胞从 2.91% 略微增加至 3.48%；巨噬细胞从 5.15% 下降到 0.26%。除了巨噬细胞亚群明显减少外，其他亚群的比例与C组相比没有明显变化。

T淋巴细胞在T1D的发病机制中起关键作用，主要为4个亚群，包括：

• 自然杀伤T细胞（NKT，表达Ly6c2、Ccl5和Cd69）
• naive T细胞/中央记忆T细胞（naiveT细胞或Tcm，主要表达Ccr7、Hbb-bs和Gm14085）
• 自然杀伤细胞（NK，主要表达Gzma、Klra8和Klra4）
• CD4⁺ T细胞（CD4⁺ T，主要表达Rora、Ikzf2和Ttn）。

除了初始T细胞或Tcm的比例明显增加外，其他T淋巴细胞亚群在D组中的比例均呈下降趋势。

DCs也经历了细胞间比例下降最显著的情况。DC被分成4个亚群，分别是：

• DCs_1（主要表达Klk1、Cd74和H2-Aa）
• DCs_2（主要表达Stat1、Runx2和Ly6d）
• DCs_3（主要表达Top2、Mki67和Hist1h1b）
• DCs_4（主要表达Prtn3、F13a1和Mcm3）

除了 DCs_1 的比例显著下降外，其他 DC 亚群在 D 组中的细胞比例略有增加。