题目：Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneous tumor and immune cell populations in early-stage lung adenocarcinomas harboring EGFR mutations
日期：2020-11-03
期刊：Oncogene
DOI：https://doi.org/10.1038/s41388-020-01528-0
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占新发肺癌病例的 85%，其 5 年生存率低于 16%。而肺腺癌 (LUAD) 成为 NSCLC 最常见的病理亚型，在年轻女性和从不吸烟者中发病率增加。携带EGFR突变的肺腺癌 (LUAD)在亚洲人群中普遍存在。然而，患者间和肿瘤内的异质性尚未在单细胞分辨率下得到解决。
文章对来自 7 个具有 EGFR 突变的 I/II 期 LUAD 样本和 5 个癌旁肺组织的总 125,674 个细胞进行了单细胞转录组测序，在肿瘤微环境 (TME) 中鉴定了多种细胞类型，并且发现ELF3是更晚期肿瘤细胞中上调最多的基因之一。
研究揭示了早期 LUAD 中存在EGFR突变的显著异质性，这表明肿瘤细胞、基质细胞和 TME 中的免疫浸润之间存在复杂的相互作用。
收集了 7 名未经治疗的早期（I/II 期）LUAD 患者（LUAD1 至 7）切除的肿瘤组织，这些患者均在肺叶切除手术中存活了长达两年。他们都携带最常见的EGFR活性突变，即L858R点突变和外显子19缺失。对照组是来自 5 个与 LUAD1-LUAD5 匹配的肿瘤相邻正常肺组织的细胞。总共拿到158,306 个细胞，其中每个细胞平均检测到 1147 个基因。后经质控过滤，剩下125,674 个细胞用于后续分析。
降维聚类得到32个cluster，并且注释得到了：肿瘤细胞、支气管/肺泡上皮细胞、骨髓细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞。其中骨髓细胞和 T 淋巴细胞占基质细胞的大部分。
免疫成分可能对肿瘤发生和进展产生至关重要的影响，于是作者首先试图研究早期 LUAD 样本中免疫浸润的特征。将所有骨髓细胞分为 14 个异质亚簇，发现大多数（~90%）骨髓细胞是表达 CD68 的巨噬细胞。与邻近肿瘤的正常组织相比，在 TME 中发现了增加的树突细胞和减少的粒细胞。
与正常组织中的巨噬细胞相比，TAMs 具有高表达APOE和SPP1，它们可促进肿瘤细胞生长和侵袭性。
富含 TAMs 的 DEGs 与细胞外基质分解、对缺氧的反应、胆固醇流出的正调节以及对 TNF 和 IL1B 的反应等途径有关，可能促进细胞迁移、血管生成、肿瘤进展和炎症。
有趣的是（图g），肿瘤和正常肺组织中的巨噬细胞都没有显示出独有的 M1 或 M2 特征。相反，它们具有相似的 M1 和 M2 特征基因的表达水平。虽然早期 LUAD 中的 TAM 似乎表达了促进肿瘤发生的基因，但它们还没有明显的 M1 和 M2分化
所有 T 细胞的聚类在肿瘤样本和正常组织之间没有显示出任何不同的 T 细胞群，因此又检查每个cluster中 T 细胞亚型标记的表达。发现肿瘤浸润性 T 细胞高表达regulatory and exhausted markers,，如TIGIT、LAYN、FOXP3、CTLA4。而正常组织中的 T 细胞高度表达effector和naive T 细胞标志物。
还鉴定了一种增殖性 T 细胞亚型（具有高 KI67 表达的c7），它显示出效应 T 细胞特征（例如，GZMA）和功能失调的标志物，如 LAG3、TIGIT 和 PD-1，表明肿瘤细胞毒活性受损。
肿瘤微环境中 T 细胞亚型的丰度与响应检查点阻断疗法的预后密切相关。T 细胞浸润和分化会受到肿瘤的许多内在特性的影响，例如细胞因子、趋化因子的局部环境以及 TME 中其他免疫细胞（包括树突状细胞 (DC)的存在。DC 在介导 T 细胞趋化性、分化和活化方面起着至关重要的作用。发现 LUAD 中的 DCs 主要是 CD1C +，这意味着它们在抑制效应 T 细胞和促进调节性 T 细胞方面的功能。
结果表明，早期 LUAD 具有免疫抑制性 TME，其中 T 细胞分化为调节性和衰竭亚型，伴随着 CD1C + DCs 的存在增加。
为了验证对肿瘤组织中恶性和非恶性细胞划分的正确性，使用特定基因的表达量来推断拷贝数变异，利用肿瘤邻近组织中的上皮细胞作为对照。具有异常 CNV 的细胞被鉴定为恶性细胞。根据它和对照得到的DEG ，进行功能富集分析将其进一步分为 8 个cluster，分别在缺氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻译起始、细胞周期和抗原呈递等途径中富集。与正常肺上皮细胞相比，Clara 细胞祖细胞标志物SCGB3A2和肺泡上皮祖细胞 (AEP) 标志物TM4SF1 在肿瘤细胞中上调。
之前看到不同的肿瘤细胞群的 DEG 富含不同的通路途径，这意味着它们之间存在渐进性异质性。
这里汇集了所有的恶性细胞并使用 monocle3 R 包构建了单细胞伪时间轨迹。Monocle3 对所有肿瘤细胞进行了降维处理，并根据它们的进展状态对细胞进行排序。作者对研究与癌症进展、TME 信号和预后不良相关的基因特别感兴趣，例如 LY6E 、NAPSA、MUC1 、ELF3 和 FOS。其中一些已在肺癌中得到很好的表征。例如，NAPSA 是 LUAD 的常见预后标志物。LY6E、MUC1和FOS在各类癌症的免疫逃逸和抑制性免疫微环境中发挥重要作用。
作者这里关注 ELF3 的作用，ELF3 是一种调节肺上皮发育的转录因子，它与气道炎症有关 并在前列腺癌和结直肠癌中介导炎症信号和肿瘤发展。
之后使用了 TCGA LUAD 数据（n = 515），发现与正常肺组织相比，肿瘤样本中的 ELF3 上调（图c）。TCGA 数据集的基因集富集分析（GSEA）显示 CCND1 和 AKT 上调的基因集在ELF3表达水平较高的肿瘤中富集。表明ELF3在更高级的 LUAD 细胞中上调，并与 LUAD 中 CCND1 和 AKT 的上调有关。
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