文章标题: Dual checkpoint blockade of CD47 and PD-L1 using an affinity-tuned bispecific antibody maximizes antitumor immunity
期刊：《J Immunother Cancer》（2区12.469 ）
发表时间: 2021/10/01
研究领域：单细胞；免疫检查点
相关临床试验：NCT04881045
CD47是免疫球蛋白超家族中的细胞表面分子，是另一个在各种恶性细胞上过度表达的既定靶标，并被俗称为“don’t-eat-me”信号的调节因子。CD47/SIRPα靶标。即使在αCD47与αPD-1/PD-L1药物联合使用时，迄今为止在实体瘤患者中也观察到有限的疗效。实体瘤缺乏疗效的一种解释是无法有效靶向肿瘤，因为CD47在循环红系，骨髓和其他造血细胞上广泛表达。所需的高治疗剂量表明，增加红细胞（RBC）的吞噬作用有可能引起严重的贫血。如果αCD47与红细胞的结合可以减少，则有可能改善贫血，并提供一种逆转肿瘤对骨髓细胞先天免疫抑制的新方法。
设计一种PD-L1/CD47双特异性抗体对PD-L1具有有效的亲和力，对CD47具有中等亲和力，以实现对肿瘤微环境（TME）中表达PD-L1的肿瘤和髓系细胞的优先结合。
抗体设计减少了对红细胞的结合并增强了对TME的选择性，与αCD47及其在同源肿瘤模型中的αPD-L1组合相比，改善了治疗窗口。髓细胞和T细胞都被激活，并有助于αCD47/PD-L1双特异性抗体的抗肿瘤活性。
设计出αCD47/PD-L1 bispecific antibody (BisAb)与CD47具有中等亲和力，与PD-L1具有高度亲和力（CD47 EC50=11.89 nM，PD-L1 EC50=0.32 nM） 。尽管对人类CD47的亲和力降低，但hBisAb阻断了SIRPα与CHO-hCD47细胞的结合。与其他人αPD-L1二价抗体（αhPD-L1）相比对于PD1/PDL1的block无统计学差异。
对人CD47/PD-L1肿瘤细胞和单核细胞来源的巨噬细胞进行了共培养测定，以检查hBisAb对抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的影响
hBisAb诱导肿瘤细胞吞噬作用的增加大于αhCD47或αhPD-L1单药治疗，hBisAb介导的ADCP增强在IgG1中明显比 IgG4更有效。
为了确定SIRPα/CD47和PD-1/PD-L1在DC介导的T细胞活化中的作用，使用混合淋巴细胞反应（MLR）
αhCD47处理减少了IL-2的分泌，而αhPD-L1单药处理及其与αhCD47的组合增加了IL-2的分泌。说明了hBisAb增强DC介导的T细胞活化的优越能力。
BisAb优先结合肿瘤细胞。鼠源αCD47/PD-L1（mBisAb）与红细胞相比，具有与肿瘤细胞相当的体外结合选择性，以及CD47/SIRPα和PD-L1/PD-1作为阻断活性。与αmPD-L1相比，mBisAb表现出增强的与肿瘤细胞的结合，表明双特异性方法比单一疗法改善了肿瘤细胞的靶向。
CT26肿瘤模型中，mBisAb显示出优于单独使用αmCD47或αmPD-L1抗体，Fc段也在mBisAb介导的治疗效果中发挥作用。mBisAb给药组的存活率（75%）也显著提高，且小鼠耐受mBisAb的给药，对体重没有影响，表明双特异性靶向方法增强抗肿瘤疗效并降低潜在的毒性作用。后面的免疫细胞相关研究说明，BisAb的治疗效果很可能由CD8 T细胞和DC同时介导。
通过CyTOF分析研究了mBisAb治疗对单个免疫亚群的影响。从肿瘤植入后第10天开始，每3-4天用对照或mBisAb治疗MC38小鼠，并在第15，20或25天收获肿瘤和脾脏。mBisAb治疗小鼠肿瘤中CD8 T细胞在总CD45细胞中增加。mBisAb治疗的肿瘤和脾脏中PD-L1染色的相同趋势可能反映了在mBisAb的存在下表位结合的竞争。
进一步了解mBisAb治疗后哪些T细胞亚群受到影响
从脾脏和肿瘤中取出mBisAb和对照处理的小鼠在肿瘤植入后第20天后（mBisAb介导的肿瘤内T细胞扩增的峰值）的T cells (live CD45CD19+−NK1.1−CD3)。与对照处理的小鼠相比，在mBisAb处理的小鼠的脾脏中的CD8 T细胞出现活化的表型(CD44++hi, CD62Llo, CX3CR1, KLRG1, T-bet, Eomes)的聚集。从植入肿瘤后第20天开始，mBisAb治疗组小鼠脾脏中表达KLRG1和CX3CR1（与效应T细胞反应相关的标志物）的CD8 T细胞成比例增加。且经过流式验证。
在mBisAb治疗中，CD8 T细胞的比例较高，而Tregs的比例相对较低。mBisAb治疗的肿瘤具有更高的CD8 T细胞效应因子功能和抗原提呈功能，关键的T细胞募集趋化因子Cxcl9、Cxcl10和Ccl5的水平也升高。
这些数据表明，mBisAb可以通过增强CD8 T细胞在肿瘤中的募集和增强肿瘤抗原的呈递来增强肿瘤内CD8 T细胞的反应。
先天免疫激活相关的途径中也有基因富集，包括 I 型 IFN 信号传导、模式识别受体 （PRR） 介导的 IFNα 通路诱导和 FcγR 依赖性吞噬作用 。双特异性靶向方法对TME具有明显的影响，无法通过单独的抗体阻断CD47和PD-L1来概括。
对mBisAb，αmCD47单独，αmPD-L1单独或αmPD-L1和αmCD47组合治疗后的MC38肿瘤进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析
单细胞分群为6个亚群，cluster 5由非经典和经典单核细胞群组成，cluster 1细胞表现出未成熟单核细胞基因Ly6c2和Ccr2以及成熟标志物Itgax和Cx3cr1的共表达。cluster 2和4为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）群体，其特征在于成熟巨噬细胞（Vcam1，Mertk，Apoe）和增殖（Top2a，Mki67）的标志物。cluster 3的血管生成和炎症标志物（Vegfa，Nos2，Mmp12）明显富集。cluster 6表现出与免疫抑制相关的标志物的表达（Mrc1，Cd200r1）。在mBisAb治疗后，TAM群表现出与抗原处理和呈递相关的基因的相对表达增加，伴随着通常与细胞周期和增殖相关的基因表达的减少。
cDC1，cDC2和mregDC群。在mBisAb处理的cDC2亚群中观察到与DC分化相关的基因相对表达的增加，对II型IFN的反应以及抗原的处理和呈递增加。
六个不同的肿瘤内CD8 T细胞簇，CD8 T细胞簇1高表达转录因子Tcf7和趋化因子受体Cxcr3---progenitor CD8 T cells。CD8 T细胞簇1细胞通常与T细胞衰竭相关的基因表达也较低，包括转录因子Tox和抑制受体Pdcd1（编码PD-1），Lag3和Havcr2（编码Tim-3），而CD8 T细胞簇2和3具有相对较高的T细胞衰竭相关的基因表达。CD8 T细胞簇3还具有与CD8 T细胞效应功能相关的基因Ifng和Prf1，Ifng和Prf1表达较高，在促进DC和巨噬细胞募集，成熟和活化方面发挥作用。
cluster 2细胞可能终末耗竭，但cluster 3保留了高效应功能的潜力。mBisAb治疗特异性增加了cluster 1干细胞样祖细胞和cluster 3效应CD8 T细胞。GO富集分析也显示mBisAb治疗使其他通路的富集，例如T细胞活化的调节，TNF产生的正调节以及I型IFN介导的信号传导的正调节，这些通路在其他治疗条件下没有富集。
这些发现表明mBisAb治疗不仅扩大了肿瘤内stem-like progenitor CD8 T cells，而且还扩大了具有高效应潜力的群体，可能是通过增强stem-like progenitor CD8 T cells向效应状态的分化。
现在猴真的很贵....探索hBisAb的毒性特征和潜在的药效学标志物
hBisAb显示出与cynomolgus monkey CD47和PD-L1相当的结合和活性，给予hBisAb后的非人灵长类药物显示CD25CD8 T细胞 和 CD69CD4 T 细胞的增加，表明hBisAb调节免疫细胞群，包括T细胞活化。
通过RNA-seq在NHP外周血样品中进行了基因表达分析。对hBisAb和载体处理样品之间的DEGs分析表明，hBisAb处理增加了与I型IFN信号传导--使肿瘤对当前的免疫检查点抑制剂敏感（STAT1，BATF2，IRF7，RSAD2，IFIT3）和骨髓细胞活化（CD80，MX1，TMEM173，DDX58）相关的基因的表达)，许多与T细胞活化（CD28，ICOS，LAG3，CTLA4）和细胞迁移（CXCL10，CCR7）相关的基因也在hBisAb治疗后富集。
综上所述，CD47是hBisAb治疗后诱导的强大先天免疫激活的主要驱动力。
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