肿瘤存在广泛的异质性，这也是精准医疗的前提。目前揭示肿瘤异质性的技术主要是有下面的4种:
其中多位点取样结合多组学已经是王炸组合了，量化肿瘤异质性后最重要的一个环节是推断肿瘤克隆进化，恰好收到了昵称是“何许”的投稿，借花献佛给大家！
肿瘤克隆进化是肿瘤研究中的宏伟命题，分析肿瘤样本中细胞群结构，可以针对性靶向肿瘤细胞治疗。这里针对发表在Nature Methods期刊上的综述解读肿瘤进化研究内容。
肿瘤具有较强的瘤内异质性，携带不同体细胞突变的肿瘤细胞群称为克隆。克隆比例随着肿瘤发展和治疗而变化。针对亚克隆结构分析主要有以下三个方面：（1）利用体细胞突变分析主要细胞群；（2）定量每个克隆比例；（3）构建不同克隆系统发育路径。
在研究肿瘤克隆进化时，单样本高深度测序会低估亚克隆数量，或者亚克隆被误认为是主克隆。而多区域取样本测序则可以提高亚克隆分辨率，有利于发育路径构建；同时增加测序深度可以区分相似CCF的亚克隆。因此，「测序更多样本比高深度测序更有利于构建亚克隆」。如图所示，Donor1的a、b、c三个区域取样，每个区域可以获取含有不同的克隆；Donor2用三个样本构建肿瘤系统发育路径要比两个样本更加准确：单个个体取a和c两个样本时，发现紫色代表的是主克隆，再增加b样本后，发现b样本不存在紫色克隆，因此是作为亚克隆存在。多样本测序可以是不同区时间取样（原发/复发），分析肿瘤进化时间特征；也可以是多位置取样（原发或者转移肿瘤多位置取样），分析亚克隆比例。
测序覆盖度和测序技术影响深度分布，进而影响克隆和亚克隆SNV检测的敏感性和特异性。肿瘤纯度和倍性也影响低CCF的SNV检测测序深度。
测序深度主要利用每条肿瘤染色体的reads数评估（NRPCC, The number of reads per tumor chromosomal copy）。NRPCC增加，真实的CCF值更清晰，更容易区分克隆簇。该方法主要通过肿瘤纯度和倍性推测合适的测序深度。癌症单样本研究，大部分样本至少一个克隆NRPCC＞10；NRPCC=10，代表纯度为50%的二倍体肿瘤测序深度为40x。
假如肿瘤倍性ψT=4，纯度ρ=0.7；ψ= 0.7×4+0.3×2=3.4，如某SNV的CCF为0.33，该突变reads占肿瘤细胞reads比例f为：，突变reads数N=f×d，因此N=NRPCC×CCF 将突变reads数量根据二项分布建模，N~Bin（f, d）。例如少于5%突变不被检测，则N＜3的概率为P＜0.05 P（N＜3）＜0.05 → → d≥91 说明测序深度必须＞91x，对应NRPCC=18.7；对于CCF=1的克隆，深度必须＞29x
WES检测CCF是比WGS和TRS更准确的。30~50× WGS实现高质量的CNA和估计亚克隆拷贝数CCF检测。但高深度测序可以准确评估CCF，和WGS相比，WES可以通过检测更多的SNV/InDel和少量的CNA准确实现亚克隆分析，并且实现对多样本测序并减少测序成本。TRS panel含有较少的基因对于等位基因特异性CNA分析是不可信的。文章对于亚克隆构建分析，推荐使用冰冻组织；因为FFPE样本的质量是不可控的，会引入CNA错误。如果必须要采用FFPE样本作为试验材料，需要优化建库和分析条件，确保检测准确的SNV和CNA。
克隆进化，主要从携带不同突变的肿瘤细胞比例维度构建系统发育路径，揭示克隆进化关系。克隆进化分析主要原理是利用VAF或者将VAF转化为携带某突变的细胞比例（CCF或CP）进行聚类分析，根据聚类簇的数量确定亚克隆的数量以及通过相关算法判断进化关系。进化树上每个分支终点代表不同克隆。主要采用两种方法分析：一种是SNV或SNV与CNA结合分析克隆进化结构；另一种是采用CNA构建进化关系。下面主要介绍这两方法的原理。
利用肿瘤纯度和拷贝数将突变等位基因频率转化为CCF或者CP。CNV导致SNV 支持reads数变化，因此这个过程中利用CNV校正VAF转化为CCF或者CR是重要的一步，或者利用正常二倍体区域的SNV聚类。二倍体区域的突变聚类适用于主要的亚克隆分析，细胞比例等于2倍的VAF，其中较高的CP为主克隆。错误来自于聚类数量错误估计或SNV错误分配。使用不当的噪音模型会导致高估或低估聚类数目。二项噪音分布可以捕捉read深度、拷贝数状态和CP准确评估SNV 的VAF。在VAF转化为CCF时也要当心，亚克隆CNV导致SNV 多重性（携带突变DNA的拷贝）增加，而且错误CNV分析可能会导致CCF＞1。
SNV聚类基于几个癌症进化的假设：① 大多数检测到VAF的SNV与少量的亚克隆相关（「弱简约性假设」）。细胞分裂产生的频率较低的阳性突变干扰体细胞突变检测，也说明亚克隆的突变是通过筛选和早期漂变决定的。低VAF的聚类可能包含多种中性平行生长的细胞；② 肿瘤发展过程中，一个特定的基因组位置只发生一次SNV，并永远不会恢复为germline碱基状态（「无限位点假设」）。每一个SNV被唯一地分配到亚克隆簇中，但无限位点假设可能会被打破，例如存在平行进化的细胞群中发生同样的驱动SNV或者三等位基因。这些事件发生比例较低，因此对SNV聚类影响较小。
亚克隆的染色体片段缺失导致该亚克隆体细胞突变消失，会打破无限位点假设。这种情况是比较常见的，并且导致假性聚类。除了忽视该区域的突变以外，还可以用Dollo构建亚克隆，假设突变仅发生一次但是后续可以消失（仅一次）。
大多方法也根据聚类数量和密度采用隐藏假设。聚类方法基于狄利克雷，具有重要的集中参数，来自于数据或者受到较强的先验约束。
Tip：最大简约性：生物演化应该遵循简约性原则，所需变异次数最少（演化步数最少）的演化树可能为最符合自然情况的系统树
① 当两个亚克隆具有相似的细胞比例时，VAF分布是重叠的，弱简约性不能将VAF更好分配给cluster。信息缺乏情况下，聚类算法会合并以上亚克隆。不确定SNV分配时，该种方式聚类在亚克隆鉴定和比例分析上具有较高可信度。
② 变异检测准确度影响聚类准确度。当germline SNPs被误检测为somatic SNV，导致CCF＞1，这样的cluster中只有较少的SNV被聚类，具有特异性的突变特征（C>T和T>C）和包含较少或者没有CNV。通过过滤数据库和较高深度正常样本测序减少以上情况。但过滤数据增加假阴性somatic SNV的数量，导致低频率亚克隆细胞比例被高估。
③ 算法假设二倍体中性状态与男性性染色体突变是有冲突的。主要解决办法是排除这些染色体上的突变。
「Tips」：（1）CCF (Cancer cell fraction)：携带某一系列突变的癌细胞占总癌细胞的比例。CCF=CP/purity. 突变频率VAF (f)，肿瘤纯度 (ρ)，局部拷贝数 (NT) 和突变多重性(m)。
（2）Cellular prevalence (CP)：某一测序样本中，携带某一突变细胞的比例（含肿瘤和正常细胞）。
（3）突变多重性 (Multiplicity of a mutation, m)：携带突变的DNA拷贝数量，。在克隆拷贝数区域，突变多重性是严格的正整数，因此通过舍入到最近的非零整数获取可能值
弱简约性和无限位点假设限制系统发育和细胞比例一致性。假设SNV只突变一次并且不恢复到germline 状态，说明子代亚群继承祖先细胞所有突变。祖先细胞比例必须大于等于它直接子代细胞比例之和。例如：子代细胞B和C具有共同祖先A，B和C之间关系未知；如果B的细胞比例大于C细胞比例，并且B细胞比例+C细胞比例＞A细胞比例，那么B一定是C的祖先，呈现线性进化（「鸽巢原理/sum rule」）。
单个样本较难确定分支进化关系。在单个样本中，当SNV聚类的细胞比例与祖先或子代CNA不兼容时，被认为是分支进化；当同一个染色体拷贝数附近或重叠区域的SNV通过read phasing发现是互斥的，会被认为是分支进化。
多样本能够较好分析亚克隆系统发育关系。例如 在某一样本中，B细胞比例＞C细胞比例，但在另外一个中，C细胞比例＞B细胞比例，B和C一定是分支进化，为“亲兄弟或表兄弟”关系。样本的越多，将会更好构建分支进化（「crossing rule」）。
注意：染色体缺失导致亚克隆突变缺失，并且违反无线位点假设，如果忽略将会导致多样本或单样本系统发育构建出错。
PhyloWGS：https://github.com/morrislab/phylowgs PhyloWGS是PhyloSub的升级版，结合somatic mutation和CNV计算克隆比例，包含三种系统发育关系可能性：（1）体细胞突变发生在CNV之前；（2）体细胞突变发生在CNV之后；（3）体细胞突变和CNV独立发生。采用无限位点和弱简约性假设。当发育关系具有多种可能时，利用马尔可夫链蒙特卡尔理论（MCMC）从后验概率模型中选取发育关系。实现克隆分析和系统发育树构建。
WGS 20~30x可以满足检测3或4个克隆，200~300x可以达到6个克隆。数据：文献采用的WGS数据，推荐30~50x
CloneHD：https://github.com/andrej-fischer/cloneHD 适用于时序和空间多样本。考虑CNV（read 深度和BAF）和somatic SNV。利用以上数据进行耦合隐马尔可夫模型推断进化关系，但不能输出进化发育树结果。Fischer A, Vázquez-García I, Illingworth CJR, Mustonen V. High-definition reconstruction of clonal composition in cancer. Cell Rep. 2014 Jun 12;7(5):1740-1752
PyClone：http://compbio.bccrc.ca/software/pyclone/ 采用无限位点和弱简约性假设，利用贝叶斯层次模型分析深度测序获取的somatic mutations（深度＞100x）和CNV结果。Pyclone输出模型参数-后验密度，经过处理得到每个输入突变的克隆比例和聚类结果。
原理：4个模型：（1）beta-binomial emission densities，对含有更多变异的数据进行克隆比例建模更有效；（2）对可能的突变基因型采用灵活的先验概率估计，反应等位基因比例与倍性相关和CNV事件一致；（3）贝叶斯非参数聚类，获取突变聚类和聚类类别；（4）同一种癌症多个联合样本，利用不同样本克隆群共享。不能构建进化树。
DPClust：https://github.com/Wedge-Oxford/dpclust 输入拷贝数变异和SNV VAF，可以输入phasing过的CNV和SNV。利用层次贝叶斯狄利克雷方法对克隆突变和亚克隆突变建模聚类。dpclust3p可以判断SNV和CNV关系，识别SNV多重性。再利用DPClust聚类。不能构建进化树。Nik-Zainal S, Van Loo P, Wedge DC, et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 2012 May 25;149(5):994-1007
SciClone: https://github.com/genome/sciclone 利用拷贝数正常区域和非杂合性缺失（LOH）区域的SNV（不限于SNV）计算克隆性。变分贝叶斯混合模型（variational Bayesian mixture model, VBMM）聚类SNV。可以输入拷贝数等校正后的SNV进行聚类。适用于WES数据、WGS数据和SNP芯片数据 Miller CA, White BS, Dees ND, et al. SciClone: inferring clonal architecture and tracking the spatial and temporal patterns of tumor evolution. PLoS Comput Biol. 2014, 10(8):e1003665.
PhylogicNDT：https://github.com/broadinstitute/PhylogicNDT PhylogicNDT Clustering 利用多维度狄利克雷原理分析细胞群和基因组发育关系：（1）避免偏差，评估克隆数量和细胞比例的后验概率；（2）利用发育树的约束条件评估最可能系统发育树。输入拷贝数、肿瘤纯度和突变结果。Cluter上的CCF值非参数分布服从狄利克雷过程；狄利克雷迭代聚类后，再利用马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)吉布斯采样器缩减每个cluster内的突变，计算被移除的突变被分配到别的cluster的概率。PhylogicNDT BuildTree 构建进化树。根据马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)吉布斯采样器每次迭代移动分枝，根据树枝整合到特定位置的多项式概率。多项式概率根据鸽巢原理计算。适用于WES和WGS数据
如图所示，肿瘤样本具有4个克隆，最终构建系统发育关系时，有两种符合进化关系，如果选择最优克隆进化树，需要更进一步分析。以下介绍几个构建系统发育关系的软件，在上述软件聚类得到克隆簇后，克隆之间的演化关系也可以用以下方法分析。
CITUP：http://sourceforge.net/projects/citup/ 基于无限位点假设和高深度测序（500~1000x）聚类突变，采用高斯噪音模型不适用于低深度测序数据。基于精确的二次整数规划（Quadratic Integer Programming, QIP）公式构建进化树。
ClonEvol：https://github.com/hdng/clonevol ClonEvol对cluster数据进行克隆排序和构建进化树。利用自举法缩减每个样本的突变数量，再计算克隆CCF，评估每个克隆CCF值的置信区间。利用sum rule和crossing rule推断无性系进化树（如克隆排序），克隆排序的概率估计是否违背以上理论；对每个样本进行进化分析，合并成一致性进化树复合每个样本内的进化关系。可视化数据和克隆进化树。
不同的克隆进化检测软件也可以在网页中使用。网页版软件集合：https://www.clab-cosine.net/cun-web/ 。相关网页文献也列举了各个肿瘤克隆进化软件分析时所使用的原理与条件，不再详述。
CNV算法利用BAF和logR是否发生改变将基因组分割成拷贝数一致的区间。LogR受到像GC含量和复制时间的局部影响，但是BAF不会受到该影响。CNV calling算法假设大部分CNV事件是克隆性的。说明BAF和logR是由整体拷贝数产生的。该假设在大部分案例中是满足的。
区域分割是CNV构建克隆结构重要的一步，它定义了每个一致性拷贝数的区域的边界。不同的分割方法导致重构的差异，一些方法采用迭代连接固定大小的片段，另一种方法采用变点检测算法。
具有整倍或者接近整倍数的CNV segments被认为是克隆性的，样本内的所有癌细胞在某个区域具有相同的拷贝状态。平均拷贝数与整数显著不一致，说明存在亚克隆CNV。接下来，CNV重建克隆需要将平均拷贝数分离（整倍数变异混合物），并确定每一类的细胞比例。对于上述问题是很难解释的：例如可能一个较大的拷贝数变化伴随着小的细胞比例。CNV计算纯度和倍性不明确也是这个原因。
对于主克隆CNV，可以要求含有主克隆CNV细胞比例相等，且与纯度相等。在中等测序深度下，拷贝数估计不准确，在某个纯度下，许多结果可能性相同，这对估计高拷贝区域的拷贝数也是一个典型的问题。针对亚克隆分析有以下三种方法：（1）全基因组方法将亚克隆CNV分组到相同的细胞比例克隆亚群。可以矫正单个segment错误，但有可能导致大规模的分组错误；（2）以变异事件为基础的方法，例如Battenberg算法，利用一系列精简原则对拷贝数segments分组。出现segment错误，但是仅限于segments。以上两种方法都不能分析一个区域出现两种以上亚克隆拷贝数状态，它们依赖于BAF和logR输入信息。（3）将亚克隆CNV分配到定义好的细胞比例中（例如，用SNV聚类）。以上方法都不能解决亚克隆拷贝数不清晰的问题。
① 低有效深度肿瘤样本检测CNV断点是有挑战的。漏掉CNV断点将导致不同拷贝数segment被认为成一个单独segment。
② 全基因组重复（WGD）导致CNV重构的模糊性，相当于任何CNV加倍和纯度降低。CNV方法经常产生多个解决方案或者选择有确定证据的四倍体，例如，最大或者最小拷贝数状态为奇数。建议只用设定纯度参数的方法构建克隆
数据中几个特征可以发现纯度和倍性的错误：
大量CNV显示为亚克隆或者已知的早期驱动显示为亚克隆，正确的纯度可能低于目前的结果。
漏掉克隆性WGD可以通过~50% CCF判断，50% CCF会是在WGD后的克隆性SNV，100% CCF代表突变发生在WGD前。
此外还可以利用SV分析肿瘤样本的克隆结构。2020年全基因组泛癌分析联盟发表了关于单个样本克隆结构的分析软件Svclone，对结构变异采用注释，计数，过滤，聚类和后续分配五步骤分析克隆结构。首先确定SV的方向和类型，计算SV的VAF；去除低质量的SV，推断断点的背景拷贝数；再对SV进行聚类和分配。
以上内容介绍了单个病人多样本取样分析克隆进化。除此之外，现有研究还针对多个个体（每个个体取多个样本）进行进化趋势或者早晚期突变分析。例如：2021年，Nature communications 期刊发表关于胸膜瘤的肿瘤进化分析。利用REVOLVER软件将21个病人（每个病人多样本取样）进化结果聚类为5类不同的进化轨迹。利用系统发育构建的鸽巢原理和求和规则，通过transfer-learning实现最大似然方法拟合和识别病人间相似的进化轨迹。计算拟合轨迹之间的进化距离，将相似的进化轨迹的病人分为同一个亚组。（该方法适用于多位置取样，不能用于时序取样）
2017年新英格兰期刊发表关于大规模肺癌人群的肿瘤进化谱系。对每个个体进行克隆结构分析，将多个样本的克隆结构结果筛选并构建系统发育关系。利用deconstructSigs分析突变特征，至少有15个突变（主亚克隆）才进行突变特征分析。
2020年，泛癌分析联盟在Nature发表关于驱动突变早期或晚期出现的特征，从整体癌症类型揭示某癌症人群的进化特征。针对单个样本分析somatic mutations和拷贝数出现的先后顺序，再在群体样本分析两个事件共发生的概率，利用联合模型分析事件时间顺序。在这个过程中得到该事件在某群体出现时序。
在阅读文献时，发现有些研究没有做肿瘤克隆进化分析，也会展示一些进化树图片。这些进化树图主要阐述的是样本之间的远近分析。也是针对单个个体多样本采用，然后在样本之间筛选共有特有突变，揭示样本远近关系。进化树上每个分支终点为不同样本。这样的分析可以采用基因组数据、DNA甲基化数据或者转录组数据实现。以下是针对每种数据类型分析方法原理的例子，不限于仅用以下描述的方法才能分析。
PHYLIP软件Wanger parsimony方法分析样本进化，利用枝干突变代表所有肿瘤共享突变。分支突变是一个以上肿瘤样本共有（非所有样本），叶突变是单个样本特有的突变。枝干长度与突变数量成正比。
一个病人所有肿瘤样本WES测到所有突变构建系统发育关系
利用最大简约法建立系统发育树，用相对拷贝数没有变化的区域作为树根，利用R包 phangorn 计算树干长度。利用1000次自展法评估进化树。
Somatic 甲基化变化，指和正常样本比改变大于0.2。在肝癌中定义表观驱动基因，只有高甲基化的表观驱动基因用来构建表观发育树。用欧式距离计算基因组和表观组的距离。利用neighbor-joining方法构建基因系统发育和表观系统发育树，利用自举法评估每个枝干的可靠性。利用Pearson相关系数计算基因组和表观组距离的相关相关性。
2021年，CANCER DISCOVERY期刊发表关于肺腺癌的研究，其中利用转录组数据揭示肺癌样本不同病理位置的基因表达和免疫浸润的变化。对每个病人的肿瘤样本染色划分4个不同的病理区域。检测每个区域基因表达水平和变化，绘制不同区域连续转录组水平变动。
样本中癌细胞占比α（单基因组），正常细胞占比 (1-α)；对于位点x，q (x)为该位点在癌症细胞的整数拷贝数；τ 为癌细胞的平均倍性，是全基因组q (x) 的平均值。样本中，位点x的平均拷贝数为α q(x) + 2(1-α)，样本平均倍性（D）为ατ + 2(1-α)。因此，位点x的相对拷贝数为
Absolute 软件评估可能的相对拷贝数到整数拷贝数，不断优化α和τ
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