小鼠肝纤维化过程中的肝星状细胞

文章信息

题目：Single‐Cell Transcriptomic Analysis Reveals a Hepatic Stellate Cell–Activation Roadmap and Myofibroblast Origin During Liver Fibrosis in Mice
期刊：Hepatology
发表时间: 2021 Aug 21
DOI：https://doi.org/10.1002/hep.31987
GEO数据库编号：GSE171904

文献概述

• 问题：肝星状细胞（HSC） 和门脉成纤维细胞 （PF） 是肝纤维化期间产生胶原蛋白的肌成纤维细胞的主要来源，具体取决于不同的病因。探究HSC从静止状态到激活状态转变的机制以及对纤维化肌成纤维细胞的影响。
• 方法：一个对照，两个不同实验组。
• 结果：在本研究中，通过scRNA-seq检测肝毒素诱导和胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型中HSC激活的转录动态。在HSC纤维化激活过程中，与静止状态相关的基因的表达迅速下调，随后是与炎症反应、细胞迁移和最终ECM产生相关的基因的顺序激活。此外，通过结合scRNA-seq和谱系追踪，我们证明了在CCL4诱导的肝纤维化中，HSC是产生胶原的肌成纤维细胞的主要来源，而在早期胆管结扎(BDL)诱导的胆汁淤阻性肝纤维化中，PFs是产生胶原的肌成纤维细胞的主要来源。此外Riociguat可激活HSC中的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，在CCL4模型中可有效抑制肝纤维化，而在BDL模型中无明显治疗作用。总的来说，在开发有效的抗纤维化治疗方法时，应考虑到不同的细胞来源和前纤维化细胞的异质性。

实验结果

小鼠肝脏的scRNA-seq分析

文章采用了两种不同的实验模型CCL4注射诱导的肝毒性纤维化模型和BDL诱导的胆汁淤积性纤维化模型，油处理的肝脏作为对照，三者进行了scRNA-seq。无监督聚类将这些细胞分为八个不同的簇，其中HSCs是最大的细胞簇。根据细胞类型特异性标记基因的表达，其他细胞簇分为内皮细胞、库普弗细胞、PF、白细胞、肝实质细胞和胆管细胞。胆管细胞可以分为两个簇Sox9⁺ 胆管细胞和Sox9^-胆管细胞，从而反映了其肝内定位和再生能力的异质性。

文章观察到HSC簇在CCL4模型或BDL模型中两者反应不同，表明HSC和PFs在肝纤维化过程中经历不同的激活机制。并确定了Gucy1a1和Gucy1b1表达仅在HSC中检测到，

HSC细胞亚群的活化过程

为了阐明肝纤维化过程中的HSC活化过程， UMAP可视化表明，HSCs可以分为两个不同的簇：qHSCs和活性HSC（aHSCs）。即在肝纤维化过程中，aHSCs上调迁移和ECM相关基因。

文章使用Slingshot包推断HSC基因表达的发育过程，拟时序确定了四个不同的基因表达模块。第一个模块的基因在qHSC中高表达，HSC激活后表达立即降低。第一个模块包含众所周知的HSC标记，如Lrat1和Rgs5，以及与血管张力和松弛相关的基因，如Gucy1a1，Gucy1b1和Vipr1。这表明HSCs不仅迅速失去其静止特性，而且还失去其血管松弛能力，导致肝内血管阻力增加和肝纤维化期间门静脉高压的发展。第二个模块的基因在早期阶段短暂上调，但之后迅速下降。第二模块的大多数基因编码炎性细胞因子，例如Ccl2和Cxcl10，它们参与细胞因子-趋化因子介导的信号通路和白细胞募集。第三个模块包含Acta2，Tagln等基因以及其他细胞迁移和收缩相关基因;它们的表达水平缓慢增加，在中期达到峰值，然后在肝纤维化期间在终末期轻度下降。第四个模块主要包含与ECM成分（如Col1a1和Col1a2）相关的基因，在HSC激活期间表现出延迟上调并在终末期达到峰值。

通过HSCs沿拟时序轨迹的相对空间分布，并根据四个基因簇的不同基因表达，将aHSCs分为三个不同的子簇，定义为1期aHSC，2期aHSC和3期aHSC。与四个动态基因表达模块一致，每个HSC簇的表达基因热图以及基因通路表达综合分析表明，1期aHSC表达高水平的炎性细胞因子，包括Ccl2，Cxcl10和Ccl7。2期aHSCs显示出细胞迁移性和收缩性相关基因的表达，例如Acta2，Tpm1，vimentin（Vim），Tagln和tenascin C（Tnc）。3期aHSC表达极高水平的ECM沉积和组织相关基因，包括Col1a1，Lox和Lum。

活化的HSC在肝纤维化过程中经历增殖以扩大产生胶原蛋白的细胞库，根据增殖标志物（Mki67和 Mcm6）的表达分析了aHSC增殖。表明，只有一小部分aHSC发生增殖，其中大多数是2期aHSC。

进一步比较了CCL4或 BDL诱导的纤维化肝脏HSC激活的差异。来自单个肝脏的HSC的UMAP和细胞比例差异表明CCL4的肝脏aHSCs显示出与BDL肝脏的aHSC不同的激活模式。

纤维化活化过程中HSC的形态动力学

随着体外活化过程中基因表达的显着变化，HSC失去了其独特的星状形状并获得独特的纺锤状肌成纤维细胞形态。然而，目前尚不清楚这种形态变化是否与体内HSC活化有关。

为了进行验证，使用Gucy1a1-EGFP小鼠来跟踪HSC形态的变化。Gucy1a1-EGFP小鼠用CCL4或BDL诱导肝纤维化。分析表明，CCL4的HSC与对照肝脏的HSC相比，经处理的肝脏显示总体积，每个细胞的分支数，每个细胞的总分支长度和每个细胞的平均分支长度显着减少。相反，来自BDL肝脏的HSC显示出每个细胞的分支数量减少;它们的总体积、每个细胞的分支数、总分支长度和每个单元的平均分支长度仍然明显高于CCL4的HSC。这一结果表明，HSC在CCL4中的激活程度更高,表明CCL4中的大多数aHSC都处于第2期和第3期，而BDL肝脏中的大多数aHSC处于第1阶段。

对照Gucy1a1-EGFP小鼠肝脏的qHSC的形态，以作为参考。为了识别不同阶段的aHSC，1期aHSC仍然保持与qHSC相似的星状形态，但2期和3期aHSC获得了纺锤形形态，细胞体积和分支数量减少。尽管如此，BDL肝脏中的HSC（即使是与胶原阳性纤维化瘢痕相邻的HSC）仍然保持星状形态，表明大多数HSC在BDL处理后没有转分化为肌成纤维细胞。

门静脉成纤维细胞（而非HSC）是胆汁淤积性肝纤维化中产生胶原蛋白的细胞的主要来源

HSC和PF在胆汁淤积性肝纤维化期间均被激活然而，它们对胆汁淤积性肝纤维化中产生胶原蛋白的肌成纤维细胞的贡献仍然存在争议。本研究中，发现BDL肝脏中产生胶原蛋白的3期aHSC的百分比很低。无法解释门静脉区域中的大量胶原蛋白沉积。表明BDL肝脏中的胶原蛋白可能主要由PF沉积。

因此通过比较PFs和HSC的单细胞转录组表达，发现PFs的基因表达模式与3期aHSCs的基因表达模式非常相似。但由于PF特异性载体的表达，包括纤维蛋白-2（Fbln3），弹性蛋白（Eln），皮肤桥蛋白（Dpt），微纤维相关糖蛋白1（Mfap1）等。此外，CCL4组PF与aHSCs相比， Col1a1和Col1a2表达水平相似，而BDL肝脏的PF表达的Col1a1和Col1a2水平明显高于aHSC。表明PFs是胆汁淤积性肝纤维化中产生胶原蛋白的主要细胞。

通过之前的研究表面，健康肝脏中PFs的百分比非常低。CCL4组中的PF数量有所增加，但BDL肝脏中的PF数量显著增加。

文章使用Gucy1a1‐EGFP小鼠进一步验证了在CCL4诱导和BDL诱导的肝纤维化中HSC和PFs对胶原生成肌成纤维细胞的贡献。共聚焦成像分析表明，在CCL4处理过的肝脏中，大多数胶原生成细胞来自于HSC亚群，因为它们是EGFP阳性的。相反，BDL肝脏中的胶原生成细胞EGFP呈阴性，但PF标记物Thy1呈阳性。值得注意的是，文章分析显示，在HSC激活过程中，Gucy1a1和Gucy1b1的表达下降。因此，为了排除在终末期激活的HSC细胞中发生EGFP表达显著降低的可能性，并精确确定HSC细胞在胆汁淤积性肝纤维化中对胶原生成肌成纤维细胞的贡献。

文章造模Gucy1a1‐CreERT2小鼠，在肝纤维化期间永久标记HSC。后续将Gucy1a1‐EGFP与Gucy1a1‐CreERT2和Rosa26‐LSL‐tdTomato小鼠进行杂交后续注射他莫昔芬进行模型的建立，测定标记效率。接下来，对8周龄的三种混合杂交小鼠进行BDL诱导胆汁郁积性肝纤维化。谱系追踪结果显示，BDL肝脏中的胶原蛋白阳性细胞主要为Thy1阳性，但EGFP和tdTomato均为阴性。因此，谱系追踪数据和scRNA‐seq分析表明，在胆汁淤积性肝损伤期间，PFs(被激活并发生剧烈扩张)是胶原沉积的主要来源，而HSC对过度胶原沉积的贡献最小。

激活sGC从而抑制HSC活化并改善肝毒素诱导的肝纤维化，但不能改善胆汁淤积性肝纤维化

多项研究表明，sGC激活试剂在不同的临床前啮齿动物模型(猪血清、CCL4治疗和高脂饮食诱导的NASH或BDL)中抑制肝纤维化。在本研究中sGC激活后Gucy1a1和Gucy1b1的表达在HSC中下降，其中3期aHSC的表达水平最低。更重要的是， BDL模型中产生胶原蛋白的细胞主要来源于不表达sGC的PFs。这些结果促使我们重新评估sGC激活剂在CCL4诱导和BDL诱导的肝纤维化模型中的治疗效果。

晚期aHSCs可能由于sGC表达的降低而阻碍其对sGC激活试剂的反应，使用治疗肺动脉高血压的sGC刺激剂Riociguat在BDL或第一剂量CCL4后1天给予。分析表明，Riociguat治疗显著减少了CCL4处理过的肝脏中的胶原沉积，天狼星红染色证明了这一点。在Riociguat治疗后，肝脏中羟脯氨酸含量显著降低，进一步证实了胶原沉积的减少。此外，Riociguat治疗还降低了血清中的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平，表明激活sGC可保护肝脏免受CCL4诱导的肝损伤。相反，Riociguat在第10天并不能减少BDL小鼠的肝纤维化和肝损伤。这些数据证实了sGC激活剂只能用于对抗肝纤维化的观点，表达sGC的aHSCs是胶原沉积的主要来源，而不是胆汁淤积性肝纤维化，在这种肝纤维化中，PFs是胶原积累的主要来源。

为了进一步了解sGC活化抑制HSCs活化的机制，文章用Riociguat刺激分离的小鼠HSC并进行bulk转录组分析。Riociguat治疗显著抑制了HSC中822个基因的表达。基因集富集分析表明，Riociguat治疗有效抑制与细胞迁移和肌动蛋白细胞骨架重排、炎性细胞因子反应和胶原蛋白产生相关的基因表达。这些结果表明，激活sGC可以有效抑制炎性细胞因子的表达以及HSC迁移，从而在早期阶段阻断HSC激活并防止HSC分化为后期产生胶原蛋白的肌成纤维细胞。

小结

文章对于肝脏纤维化的scRNA-Seq进行分析。主要对其中的肝星状细胞（HSC）进行探究。对于HSC在肝纤维化疾病的发育时期的各个特点进行了详细的研究，并确定了在不同致病条件（胆汁淤积/化学药物）下所产生的肝纤维化特征的细胞群不同之处。后续的实验对于SCrna各个亚群的存在与基因表达进行验证，更好的与单细胞分析相结合。文章中的湿实验也是比较完善的，我个人有好多没有接触或者了解过，通过文献学习一些实验的思路。

本篇文章中主要是对于HSC细胞进行的细分探究，区分为四种状态并一一验证。对于HSC的各个时期的状态也进行了标志基因的展示，这里我个人认为也可以当作HSC亚群的细分可以区分出四种亚群，使得HSC有关信息更充分，可以作为后续研究的参考。

文章只有三个样本，单细胞数据量小而且进行复现的难度也不是很大，我个人在复现的时候大部分数据结果是和文章一致的，有兴趣的同学可以学习一下。