转录组差异分析方法越多越好吗

交流群有小伙伴问为什么推荐 DESeq2 做转录组测序的表达量矩阵差异分析，那么多其它软件可以选择啊，以及是不是可以多用几个软件然后取交集保证结果的一致性。

其实一般来说呢，多种转录组差异分析方法可以提供更全面和准确的结果，但是过多的方法也可能导致方法间的冲突和结果的混乱。让我想起来了好久以前看到的一个综述：Costa-Silva J, Domingues D, Lopes FM (2017) RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool. PLoS ONE 12(12): e0190152. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0190152

系统性测评了转录组测序数据分析的上下游软件的组合，包括4中比对软件（ BWA, TopHat, Bowtie and STAR mappers）以及两个非比对定量软件（ Salmon and kallisto ），以及9个差异分析算法软件，如下所示：

上下游软件的组合

文章提到的9个差异分析算法软件如下所示：

9个差异分析算法软

每个差异分析算法背后都是统计学假设和模型，大概率超出了绝大部分小伙伴的理解能力。那我们直接看9个算法比较后的汇总结论：

9个算法比较后的汇总

因为使用了qRT-PCR来验证算法找到的差异表达基因，所以默认实验结果是金标准。可以看到，9个算法一起错误的有19个差异基因，绝大部分差异基因都至少会被1~5个算法找到，全部的9个算法都一致的基因是没有的，哪怕是被8个工具支持的差异基因也很少。

也就是说， 希望全部的算法都很一致是不切实际的，一半以上的工具支持基因有差异表达就很可信了其实，退一万步说，仅仅是单一工具算法找到的基因其实也问题不大。

当然了，这个结论很口语化， 感兴趣的可以看统计学数据， 文章的 Fig 5. Projection curves of TPR and SPC. 和  Fig 4. ROC curve from integration of DEG identification methods.

上面的汇总是从实验验证的真正的差异表达量基因来考虑，其实实验总共涉及到接近1000个基因，qRT-PCR (gold standard) with 413 DEGs and 584 not differentially expressed transcripts, totaling 997 genes analyzed.

也可以从假阳性的角度考虑这些算法，感兴趣的可以去读综述：Costa-Silva J, Domingues D, Lopes FM (2017) RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool. PLoS ONE 12(12): e0190152. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0190152

最后，让我们一起来看看chatGPT的回答吧！

what's the best methods for DEG analysis

所以，大家完全不需要纠结选择什么软件什么算法，主流的ngs技术都有成百上千个软件组合可以选择了，但是这些ngs数据都是高通量的批量分析，所以压根就不需要保证百分比精准，只需要趋势是对的，提供一些信息给科研工作者即可。