基于单细胞分析人心衰中炎症和纤维化的相互作用

文章信息

题目：Resolving the intertwining of inflammation and fibrosis in human heart failure at single-cell level
日期：2021年10月
期刊：Basic Research in Cardiology
DOI：https://doi.org/10.1007/s00395-021-00897-1

摘要

心衰过程中存在炎症和纤维化相互交织的过程。探究衰竭心脏中基因表达变化与白细胞和非心肌细胞之间的细胞联系对理解细胞特异性很关键。为此，我们对人类扩张型心肌病(DCM)和缺血性心肌病(ICM)心脏的200,615个细胞进行了单细胞RNA测序和单T细胞受体测序。我们从每个心脏的病变和轻度病变组织中取样，依次分析心脏纤维化不同程度的细胞和分子改变。取DCM心脏左心室(病变)和右心室(轻度病变)，同时从ICM心脏剥离梗死区(病变)和非梗死区(轻度病变)。结果发现转录因子AEBP1是ACTA2⁺肌成纤维细胞中至关重要的心脏纤维化调节因子。在纤维化心肌内，可见大量白细胞的浸润，尤其是细胞毒性CD8⁺ T细胞和促炎CD4⁺ T细胞。此外，组织内巨噬细胞的一个亚群CXCL8Z^hiCCR2⁺HLA-DR^hi巨噬细胞在严重纤维化区域被特别鉴定，它通过DARC与活化的内皮细胞相互作用，可能促进白细胞的募集和浸润。

背景

• 心衰是一种慢性进行性疾病，其发病率、死亡率高；
• 心衰过程中有复杂的重塑过程：心肌死亡、纤维化、血管生成等，涉及多种细胞；
• 有研究报道巨噬细胞在其中有很重要功能，但机制不明；
• 晚期心衰中免疫细胞的成分及功能尚不明确。

方法

• 取接受心脏移植的DCM（3个）、ICM（3个）患者、正常供体（2个）心肌组织，分离心脏细胞，收集相应患者PBMC；
• 流式细胞术分选；
• 10×单细胞测序；
• RNA表达、细胞连接、细胞轨迹、转录因子调控分析；
• 免疫组化。

结果

心衰细胞类型

• 3个DCM, 3个ICM, 2个非衰竭供体心肌病变部位与轻微病变部位组织；
• 病理检查显示，与DCM RV和ICM NMI相比，DCM LV和ICM MI纤维化更严重(图1C)；
• 与正常心脏相比，衰竭心脏中CD45+细胞含量增加(图1D)；
• scRNA-seq实验共使用了来自8个个体的40个样本，经过严格的质量控制筛选，共产生165,999个细胞；
• 聚类分析揭示了13种主要的细胞类型。基于典型标记，CD45细胞包括成纤维细胞(FBs)、内皮细胞(ECs)、平滑肌细胞(SMCs)、周细胞(PCs)、心内膜细胞，而CD45+细胞包括T细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、B细胞和骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞)(图1E)。每种细胞类型的特征基因表达也推断出稳健的细胞聚类(图1F)。

AEBP1是一种新的心脏纤维化调节因子，在活化的成纤维细胞和成肌细胞中起作用

• FB谱系包含8个子集(图2A, B)；
• 差异基因显示，与DCM RV和ICM NMI相比，DCM LV和ICM MI中促生长特征(POSTN, CTCF, AGT, COL1A2, COL1A2, COL3A1和THY1)区别更为明显；
• 基质myoFB高表达的不同类型胶原主要存在于ICM心肌中，类似于完全成熟的纤维化瘢痕 (图2C)；
• 基质myoFBs、活化的myoFBs和活化的myoFBs均表现出高度集中的ECM组装特性和活跃的增殖特征(图2D)。
• 在正常心脏中，C1和C2静息FBs占主导地位，具有最小的ECM特征(POSTN和COL1A2)(图2B, C)。脂源性FBs高度表达DLK1，可以抑制小鼠肌myoFB的转化，这可能是HF中潜在的纤维化抑制机制；
• 单细胞分析显示，FBs在遗传特征上具有异质性，这与它们的空间分布有关。

• 时间轨迹分析显示，转录因子AEBP1在活化的FBs和活化的myoFBs中表达增加(图2E)，与纤维化标志物COL1A2和POSTN相关。
• DEG分析，将DCM LV与RV、ICM MI与NMI进行比较，AEBP1在更多纤维化心肌中高表达。
• 对15颗正常心脏和52颗衰竭心脏的LVs进行大量RNA测序进一步支持了这一现象，AEBP1在HF中显著上调，其表达与POSTN和COL1A2相关(图2F)。
• 免疫荧光证实了病变心脏纤维化细胞中AEBP1的表达(图2G)。
• 激活的FBs和myoFBs中AEBP1共表达基因的GO分析显示，ECM的产生和组织富集(图2H)。
• FAP、POSTN、THBS4等纤维化基因和VCAN、BGN、COL1A2、ELN等细胞外基质基因与AEBP1共表达，可能分别在活化FB和活化myoFB中作为AEBP1的靶点(图2I)。
• 上述结果强烈表明AEBP1可能是一种新的纤维化调节剂，通过激活FB和激活myoFB在晚期HF中起作用。

功能失调的CD8⁺ T细胞和促炎的CD4⁺ T细胞在病变部位的浸润是心脏炎症的原因

• 首先根据T细胞表达情况评估免疫细胞成分在衰竭心脏的变化。结果表明CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞在衰竭心脏中增加，但外周血T细胞的表达明显不同。
• 根据单细胞T细胞受体(TCR) VDJ测序分析T细胞身份和识别相应的T细胞转录谱，采用STARTRAC分析来量化不同T细胞亚群的克隆扩增、组织迁移和状态转移。根据典型标记和特征表达对25个亚群进行了注释(图3A)。在CD8⁺ T细胞中，鉴定了naïve (TN)、中枢记忆(TCM)、效应记忆(TEM)、效应(TEFF)和最近激活的效应(TEMRA)亚群，以及一小部分耗竭的CD8+ (TEX) T细胞，它们表现出PDCD1和LAG3的高表达。
• 在CD8⁺ TEFF、CD8⁺ TEMRA、血液TEM、TCM、组织TEM和TEX细胞中，观察到细胞毒性特征(NKG7、PRF1、GZMB、GNLY)依次下降，细胞周期阻滞特征增加(图3B)。
• CD8⁺ TEFF和CD8⁺ TEMRA细胞具有高增殖能力，具有较强的STAR TRAC迁移评分，表明效应CD8⁺ T细胞主动迁移到心肌并在心脏内扩张(图3C)。
• 具有相同TCR的细胞也可以阐明不同T细胞簇之间的关系，共享TCR的使用意味着CD8⁺血液TEFF经历了广泛的状态转变，并在心肌中发展为CD8⁺ TEMRA细胞(图3D)。
• 考虑到由TCR序列定义的T细胞克隆，配对STARTRAC反式指数定量描述了T细胞内的发育转变。我们可以观察到CD8⁺ TCM、血液CD8⁺ TEM、CD8⁺ TEFF、CD8⁺ TEMRA、组织CD8⁺ TEM和CD8⁺ TEX细胞之间广泛而紧密的状态转变(图3E)。
• 为了了解CD8⁺ T细胞的发育，作者构建了上述细胞亚群的伪时间轨迹(图3F)。结合RNA速度，观察到CD8+ TEFF群体被激活，分化为CD8+ TEMRA细胞，并进一步发展为组织CD8+ TEM细胞，最终经历衰竭，产生CD8+ TEX细胞，TCR克隆分析证实了这一观察结果(图3D)。与在癌症中观察到的CD8+ T细胞衰竭类似，CD8+ TEX群体下调其细胞溶解和增殖能力，并表现出极低的状态转换和迁移能力图3B, G)。
• 毒性CD8+T细胞在心衰中失去作用并消耗殆尽。

• 在CD4⁺ T亚群中，检测到CD4⁺ TN、CD4⁺ TEFF、CD4⁺ TCM、CD4⁺ TEM和CD4⁺ TRM，以及两个高表达GNLY和GZMH的CD4⁺CD28^low T细胞亚群。CD4⁺ TN、CD4⁺ TEFF和CD4⁺ TCM细胞主要出现在血液中，而CD4⁺ TEM和CD4⁺ TRM细胞仅在心肌中富集。
• 作为一组产生IFN-γ的细胞，CD4⁺ TEM细胞具有强烈的促炎特征(图3B)。
• CD4⁺ TRM细胞特异性表达组织修复促进蛋白AREG。两个CD4⁺ CD28^low T细胞亚群在ICM中特异性富集(图3A)。CD4⁺CD28^low T细胞呈组织间分布，高表达组织穿梭基因S1PR1和ITGB7。观察到他们在CD4⁺ T细胞中具有最高的STARTRAC迁移评分，并证实了这一特征(图3G)。
• CD4⁺CD28^low T细胞可能与CD4⁺ TEM发生转变(图3H)。
• 轨迹分析证实，CD4⁺CD28^low T细胞和促修复CD4⁺ TRM细胞独立转化为细胞毒性较低但促炎症的CD4⁺ TEM细胞，从而导致心力衰竭的最终状态(图3I)。跨CD4⁺ T细胞簇的相同T细胞克隆也验证了它们的连接状态(图3D)。先前报道的转录因子，如BATF、BHLHE40和RBPJ，在促炎CD4⁺ T细胞的发育过程中上调。
• 因此可以推测，由于在衰竭心脏中大量充盈的CD8⁺ T细胞的细胞毒性得到缓解，阻止CD4⁺ T细胞的促炎转化将是一个有利而有效的抗纤维化方向。

CCR2⁺HLA DR^hi 巨噬细胞是促进衰竭心脏炎症的主要组织常驻免疫细胞

• 在数据集中检查了髓细胞，髓细胞集群鉴定了13个集群:CD14⁺ 单核细胞(mono)， CD16⁺ 单核细胞，树突状细胞(dc)，炎性dc，浆细胞样dc，肥大细胞和巨噬细胞(图4A)。
• 比较三组巨噬细胞的转录谱:衰竭心脏与正常心脏，DCM的左室和右室，MI的NMI和ICM，用来找到调控心脏纤维化和炎症的共同途径。结果发现，在纤维化程度较高的心肌中，高表达的基因容易富集于白细胞趋化性(CXCR4、CXCL8、CXCL2和IL1B)、抗原加工和呈递(HLA-DRA和HLA-DRB1)和细胞因子分泌(NLRP3、EGR1和BIRC3) 。相反，正常心脏或较少纤维化的心肌在细胞呼吸、内吞作用、LDL颗粒清除和模式识别受体信号通路等与稳态相关通路中表达更为明显；与DCM RV和ICM NMI相比，DCM LV和ICM MI分别显示出更明显的造血和趋化基因表达。
• 综上富集在严重纤维化区域的巨噬细胞可以激活NF-b信号通路。
• 在测序数据中，巨噬细胞可以根据CCR2和MHC II类分子表达进一步分为不同的亚群:CCR2^-HLA-DR^hi 和CCR2⁺HLA-DR^hi 巨噬细胞。此外发现了一个新的TREM2⁺ 亚群，其特征与小鼠主动脉TREM2⁺ 巨噬细胞相似。LYVE1，VSIG4和FOLR2的表达确定了CCR2^-HLA-DR^hi, CCR2⁺HLA-DR^hi C1, CCR2⁺HLA-DR^hi C2和TREM2⁺ mφ簇作为组织常驻群体，而CCR2⁺HLA-DR^hi C3可能是新增长的子集。
• 在患病心脏，CCR2^-HLA-DR C1/C2倾向于在DCM RV和ICM NMI中富集，而CCR2⁺HLA-Dr^hi C1/C2优先分布于DCM - LV和ICM – MI(Fig. 4B)。
• 因此，分别对CCR2⁺HLA-DR^hi C1/C2和CCR2 HLA-DR^hi C1/C2进行了DEG分析。CCR2 HLA-DR^hi C1高表达与负性免疫调节基因(LILRB5、MAF、SIGLEC1)、组织驻留(LYVE1)和体内平衡(SLC40A1、BLVRB、STAB1、DAB2)相关，而模式识别受体(CLEC4E、CLEC7A和CLEC10A)在CCR2 HLA-DR^hi C2中上调(图4C、D)。CCR2⁺HLA-DR^hi C1显示出高吞噬促进因子(C1QA和C1QB)，但CCR2⁺HLA-DR^hi C2积极表达NLRP3炎性体和NF-kb信号传导中的关键成分(图4C, D)。
• DEG分析反映，与CCR2 HLA-DR^hi C1和CCR2⁺HLA-DR^hi C1相比，CCR2 HLA-DR^hi C2和CCR2⁺HLA-DR^hi C1可能分别处于促炎状态，促血管生成趋化因子CXCL8在CCR2⁺HLA-DR^hi C2细胞中上调，特别是在DCM LV和ICM MI中高表达(图4D, E)。
• 通过大量RNA测序(52 HF和15正常心脏)验证了CXCL8表达的增加(图4F)。通过免疫染色进一步证实了CXCL8⁺巨噬细胞在衰竭心脏中的富集(图4G)。
• 综上所述，CCR2⁺HLA-DR^hi巨噬细胞在心力衰竭中起促炎作用。
• 进一步研究了巨噬细胞在衰竭心脏中的发育联系。CCR2⁺HLA-DR^hi C3(右分支)和TREM2⁺ mφ(中间分支)都可能与组织驻留子集:CCR2⁺HLA-DR^hi C2(图4H)连接，参与巨噬细胞分化的转录因子ATF3和KLF4可能促进了从CCR2⁺HLA-DR^hi C3向CCR2⁺HLA-DR^hi C2的转变(图4H)。单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)分析也表明，ATF3和KLF4调控在CCR2⁺HLA-DR^hi C2中是开启的(图4I)。
• 上述所有分析都支持CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi巨噬细胞可能来自增多的CCR2⁺HLA-DR^hi C3和TREM2⁺ mφ在衰竭心脏中发挥独特的促炎作用。

在严重纤维化的心肌中，内皮细胞发生重构，活化的内皮细胞具有白细胞募集潜能

• 研究发现血管内皮细胞是最普遍的内皮细胞谱系，而淋巴内皮细胞仅占一小部分(图5A)。
• 在病变心脏中，与DCM RV和ICM NMI相比，活化EC在DCM LV和ICM MI中富集。CD36和AQP1暗示了活跃的代谢状态，活化的EC有独特的细胞周期(图5B)。趋化细胞因子CCL14、趋化因子DARC的Dufy抗原受体和内皮-白细胞粘附分子SELE在活化的ECs中特异性表达(图5B) 。
• 活化的内皮细胞具有显著的内皮活化特征(图5C)，转录因子NR2F2和CEBPD与该EC亚群相关(图5B)。NR2F2是诱导静脉命运和拮抗动脉命运的主调控因子，而CEBPD参与激活各种炎症基因的转录。
• 参与白细胞募集的细胞粘附分子(VCAM1, SELE, SELP)与NR2F2密切共表达(图5B)，突出了该亚群的白细胞募集潜力。此外免疫荧光验证了激活的EC在衰竭心脏中占一个亚群血管(图5D)。
• 数据中出现的其他功能性EC组均为促血管生成EC，与小鼠缺血损伤中的观察结果一致(图5A)。可以确定三个亚群:(i)促血管生成EC C1细胞，其高表达HEY1，可能介导哺乳动物动脉细胞命运决定和促血管生成作用(图5C);(ii)促血管生成EC C2细胞，具有发芽特征;(iii)促血管生成EC C3细胞特异性表达TNFRSF4，提示其可能与T细胞相互作用。
• 研究结果揭示了EC谱系复杂的细胞组成。为了进一步研究与纤维化相关的EC重塑，并将DCM LV和ICM MI衍生的EC分别与DCM RV和ICM NMI进行比较，检测到在更多的纤维化心肌中激活了参与ROS、趋化因子、IFN-和TNF的基因。这些结果表明，内皮细胞炎症，特别是在活化的EC中，也与纤维化密切相关。

CXCL8^hiCCR2⁺HLA DR^hi巨噬细胞通过DARC与活化的内皮细胞相互作用，可能促进心力衰竭中白细胞的募集和浸润

为了研究HF期间细胞相互作用的重新布局，作者将受体-配体对映射到细胞亚群上，通过CellPhoneDB构建了一个假定的细胞相互作用网络，并总结了相互作用的配体-受体对。DCM LV和ICM MI分别比DCM RV和ICM NMI更具有纤维化，每个样本中CCR2⁺HLA-DR^hi C2细胞的比例与活化ECs的比例之间存在很强的相关性(图5E) 。细胞间相互作用分析发现，CXCL8-DARC是CCR2⁺HLA-DR^hi C2细胞与活化EC之间最重要的相互作用对。CCR2⁺HLA-DR^hi C2细胞高表达CXCL8，而其受体DARC在活化EC中表达(图5F)。DCM和ICM心脏组织的多色免疫组化染色证实了表达CXCL8的巨噬细胞和表达DARC的ECs的并存(图5G)。从外植心脏中分离出活化的内皮细胞，并将其暴露在CXCL8中72小时。CXCL8刺激的活化的内皮细胞从鹅卵石形状转变为细长形状，通过大量RNA-seq检测参与细胞粘附和白细胞浸润的上调基因。刺激后，高表达基因的功能主要与I型干扰素信号通路、血管生成调控和细胞基质粘附相关(图5H)。这些结果进一步支持CXCL8可以激活内皮细胞并潜在地增强白细胞浸润(图5I)。

结论

本研究首次提供了成人衰竭心脏中白细胞和非肌细胞的单细胞转录组图谱。除了提供参考信息外，还报告了相互作用网络以启发进一步的机制研究。

本研究主要发现:

• (1)人类衰竭心脏成纤维细胞发生广泛的表型重塑，AEBP1可能是一种新的心脏纤维化调节剂，主要作用于POSTN⁺成纤维细胞和ACTA2⁺肌成纤维细胞。
• (2)大量的细胞毒性CD8⁺和促炎性CD4⁺充盈到衰竭的心脏，但CD8⁺ T最终会耗尽，CD4⁺ T增加炎性。
• (3)作为主要的组织常驻免疫细胞，CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi巨噬细胞亚群优先定位于严重纤维化心肌，促进白细胞募集和炎症。
• (4)一个独特的DARC + EC亚群与心脏纤维化有关，并在人类心力衰竭中与CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi巨噬细胞相互作用。这种连续的关系可能潜在地促进白细胞浸润，加重持续的心脏炎症，进一步恶化心功能。