单细胞测序鉴定银屑病的致病细胞亚群

文章信息

文章题目：Single-cell RNA sequencing of psoriatic skin identifies pathogenic Tc17 cell subsets and reveals distinctions between CD8+T cells in autoimmunity and cancer
期刊：Journal of Allergy and Clinical Immunology
日期：2021年6月
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2020.11.028

摘要

牛皮癣是一种IL-17 驱动的炎性皮肤病，自身免疫原诱导的CD8⁺T细胞被认为是主要的作用细胞。

本文中主要对健康皮肤、银屑病皮肤里的CD8⁺T 细胞进行单细胞测序。

1. 鉴定出银屑病皮肤中富集的两个Tc17细胞亚群，代谢不同，表达CXCL13。这个CXCL13可以作为 银屑病严重程度的一个指标，在银屑病和健康转录组的支持向量机分类器中实现了与 IL17A 相当或更高的准确性。
2. 将银屑病Tc17细胞亚群与黑色素瘤浸润的 CD8⁺T 细胞进行比较，发现这些细胞中细胞因子、溶细胞和代谢转录活性的上调，这与衰竭程序不同。

结论：使用组织中的高分辨率单细胞分析，我们发现了银屑病和健康皮肤中 CD8⁺T 细胞的异质性，包括与疾病严重程度相关的2个未耗尽的 Tc17 细胞亚群。

方法

• 消化：
  取下来的皮肤，放在4℃PBS中。去掉毛发、皮下组织后，过夜消化：5% CO2 in RPMI 1640 medium containing Collagenase Type IV (LS04188, Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ), DNAse (DN25-1G, Sigma-Aldrich, St Louis, Mo), 10% FBS, 1% HEPES, and 1% penicillin/ streptavidin.分选出CD8⁺T细胞
• 建库：
  SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit ，Illumina HiSeq 4000
• 数据处理：
  ①  STAR 2.4.2a，GRCh38，GENCODE 25，HTSeq 0.6.1p1，R 3.4.2, GSE146264
  ② 数据过滤：(<100,000 mapped reads, <1,000 mapped genes, >25% reads mapped to ERCC, or >25% reads mapped to mitochondrial genes).

结果

细胞聚类

质控后的细胞：

• 银屑病：2919个CD8⁺T细胞，
• 正常皮肤：1656个CD8⁺T细胞。

分11个亚群。clusters 0, 1, 2, 4, 5, 7, 8在正常皮肤，银屑病皮肤中都有。cluster3大部分来自正常皮肤，cluster6和10绝大部分来自银屑病病人。总结11个病人的样本中，11个病人富集cluster6，8个病人富集cluster10。

银屑病皮肤中的炎性CD8⁺T 细胞亚群

接着研究银屑病皮肤中的CD8⁺T 细胞。看了已知的T细胞marker在各群的表达。如下图A。健康皮肤多的亚群，如cluster1，2，3，5，炎性子表达的少。然后又看了不同亚群细胞周期基因的表达情况。cluster8处于相对静止的状态。

银屑病皮肤细胞群多的cluster0，4，6，7，10，炎性特征比较明显。cluster9 高表达TNF，IFNG。cluster0高表达GZMK,GZMA,KLRG1。cluster4高表达CCR7, KLRG1,CXCR3.cluster 6和10高表达IL17A.

Tc17细胞亚群表达CXCL13

对银屑病人中富集的cluster6，10格外感兴趣。发现他们都高表达CXCL13，下图图A。CXCL13接到B细胞招募到淋巴组织。且CXCL13的高表达与IL17A 有相关性，下图图B。对银屑病皮肤样本染色CXCL13,IL17A，发现二者共定位。

接着作者用了四个公共数据库的数据证明了CXCL13在银屑病皮肤中的高表达。

• ①39个病人的临床试验中CXCL13在血清中的浓度更高，图E
• ②17个病人银屑皮肤的CXCL13的基因表达更高，随着anti-IL13的治疗，表达量下降。图F。
• ③ bulkRNAseq，82个正常病人，92个银屑病人的皮肤测序，使用 CXCL13 表达对健康和银屑病皮肤样本进行支持向量机分类，无论是单独使用还是与 IL17A 结合使用都实现了高度的准确性，图G
• ④ 在58个银屑病和64个正常皮肤的芯片测序中也发现了类似的结果。

比较银屑病人Tc17 亚群和黑色素病人浸润的CD8⁺T细胞

之前的文献中有对黑色素瘤浸润的T细胞失能打分。作者把方法应用在自己的数据集，发现Tc17的两群cluster6和10得分最高，cluster1，3，8得分最低，图A。图B表示了共抑制receptor的表达。图C 是代谢打分。图D，银屑病cluster6和10，细胞毒性T细胞通路变道上调，而exhausted 肿瘤浸润的淋巴细胞里没有。

Tc17亚群之间的发育关系

最后，分析了TCR-spining reads，以对健康皮肤和银屑病病变中的 CD8⁺T 细胞之间的克隆型扩增和分化动力学进行有限的比较。在 7304 个单细胞转录组的初始数据集中，研究者通过组装它们的 TCR 跨越读数重建了 4908 个 CD8⁺T 细胞（每个受试者平均 62% 的输入细胞）的 TCR 库。在每个受试者中，这些细胞代表平均 224 个独特的“克隆型”，此处将其定义为具有完全匹配的 TCR 序列集的细胞组推断的 CDR3 区域的比较。

细胞群之间共享的 TCR 序列和克隆型提供了产生2种表型不同的 Tc17 细胞亚型的分化过程的证据。从每个 CD8⁺T 细胞群中，细胞群之间共享 43 到263个TCR（即，可以在同一受试者的不同细胞群中发现的TCR序列）。尽管通常在所有其他集群中检测到给定cluster的共享 TCR（图 5，A 和 B），但它们在每个其他集cluster中的平均比例显着不同（Kruskal-Wallis P < 10-4 对于共享的 TCR 集所有集群）。特别是，cluster10 的共享 TCR 被检测到最频繁（平均而言，在cluster 6 [Mann-Whitney P < .001] 中，在较小程度上，在cluster 4 所代表的激活亚型中 [Mann-Whitney P < .04]）。反过来cluster 6 的共享 TCR 最常出现在cluster 4 中（Mann-Whitney P < .04），这表明这些cluster中的细胞可能来自从cluster 4 到cluster 6 再到cluster10. 与这种发育关系一致，在cluster 10 中的 13 种克隆型中也存在于其他cluster中，在cluster6 中也检测到了 8 种（62%）。

讨论

TCR 和表达数据阐明了银屑病病变中炎症亚型的分化。直觉上，cluster 0、4、6 和 10 之间共享的 TCR 序列和克隆型将与由cluster 4 代表的激活的皮肤归巢 CD8⁺T 细胞分化为任一细胞毒性效应物（由簇0代表）的模型一致。) 或 Tc17 细胞效应器（由cluster6表示），根据先前的观察，产生 IL-17 的 CD8⁺T 细胞可以产生体外产生IL-22 的亚群。

小结

本文内容不多，杂志期刊影响因子较高。作者通过其他数据库的数据交叉验证自己的测序结果。显得结果可信。