作者：赵军杰 程林丽 陈亚南 栾业辉
导读：动物源食品中各种抗生素残留对人类和动物健康、食品安全以及环境的潜在危害达成世界共识，相关检测技术不断发展变化、日趋成熟，但也带来了新的机遇和挑战。文章对目前抗生素残留检测方法的最新研究进展进行了调查和综述。结果表明：当前仪器检测法、微生物检测法、免疫测定法和生物传感器法都得到了长足的发展；发展新型检测仪器、研究新的样品前处理材料和技术以及开发多种药物甚至是不同种类的药物协同检测方法为当前残留检测技术的趋势和方向。全文已在《饲料工业》2022年第20期刊出。
多年以来，世界各国和国际组织对抗生素残留引起的耐药性问题，动物健康、食品安全以及环境问题已达成共识，相关合理规范使用的政策和监控措施不断发展和变化。我国农业农村部194公告颁布之前，抗生素普遍用于预防和治疗感染性疾病、促进生长和提高饲料功效。但是该公告规定，自2020年7月1日起，禁止使用除中草药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，导致该公告实施生效之后，我国对动物源食品中抗生素残留的监督控制更为严格。但不乏有些养殖者的法律法规意识淡薄，为取得高效益，违规私自使用抗生素用于促生长等多种用途，导致残留情况加重。这些残留的抗生素通过食物链进行富集并向人类转移，产生耐药性以及一系列的毒副作用，如肝肾毒性和致癌性等，对食品安全以及人类健康产生了潜在威胁。而残留监控是控制动物源食品中抗生素残留的重要措施，因此相应检测方法的进一步发展就显得极其重要。
抗生素残留检测技术作为一种控制药物残留的重要手段和方法，在提升动物源性食品的质量安全、保障人民身体健康、改善环境污染及促进畜牧业发展方面发挥了重要作用。现有研究已建立多种方法来检测抗生素残留，目前主要应用的方法有四类：仪器检测法、微生物检测法、免疫测定法和生物传感器法。文章就这四种方法在动物源性食品抗生素残留检测上的应用进展进行综述。
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仪器检测法
仪器检测法用于抗生素残留的定性和定量分析。主要包括液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用的分析技术，如液相色谱-质谱法（LC-MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、气质联用法（GC-MS）和气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）等，以及后续发展出的超高效液相色谱法（UPLC）、UPLC-MS/MS等方法。当前常见的方法示例见表1。仪器检测方法除了需要针对检测对象优化仪器检测条件，还需要对样品进行一定的提取净化处理后再上机检测，程序略显复杂，难以实现大量样品的现场快速检测，常被各国政府和第三方机构用于对目标抗生素的日常监控检测。
由表1可知，在对动物源食品中抗生素的残留检测的定量分析和确证检测上，LC-MS/MS方法应用最为广泛，它具有选择性强、灵敏度高的优点，在多个种类的药物分析中均有应用。UPLC-MS/MS作为LC-MS/MS的更新替代种类，随着该类新型仪器的推广会得到更广泛应用。LC-MS方法多用于在一定条件下的性质不稳定或者不易获得二级质谱离子的药物，比如多肽类药物。GC和GC-MS应用于容易汽化的药物，而抗生素与农药不同，满足这个要求的药物种类十分有限，因此应用较少。HPLC方法因其优秀的定量分析能力仍具有一定的用途，并未完全被LC-MS及LC-MS/MS方法替代。
一般认为，动物组织样品中，肝类样品的基质成分最复杂，对其中残留的抗生素等药物进行仪器分析前需采取复杂的前处理程序充分提取和净化样品。肉类组织样品次之。脂肪类样品中基质成分相对较简单，但因为脂肪含量高，常常对其中的药物呈现包裹状态，对一些非极性、大分子量的药物提取和净化具有一定的难度。蜂蜜类样品含糖量和含水量高，其他基质成分含量很少，相对来说比较容易提取和净化。当然，对残留药物提取净化程序的难易，以及仪器检测条件的设置难易也与药物本身的理化性质紧密相关。
LC-MS/MS适用于在特定的试验条件下对目标抗生素进行有效分析，对样品要求比较高，所用的前处理技术较为复杂。固相萃取技术（SPE）是常用的前处理技术，是传统液液萃取更有效的替代方法。根据固相萃取小柱填料的不同，有C18小柱、C8小柱、混合亲和吸附小柱、阳离子交换小柱、阴离子交换小柱、酸性/碱性/中性氧化铝小柱、氟罗里硅土小柱、硅胶柱等。这些小柱利用化合物、溶液与小柱填料的三者相互作用进行净化，净化原理多样。为了获取最佳的固相萃取性能，选择合适的萃取小柱至关重要，如oasis-HLB小柱是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂，即使使用过程中小柱的柱床干涸，回收率也不受影响，适合大多数抗生素的分析，一般认为通过调节淋洗和洗脱条件，可与C18小柱作为相互替代和优化的方法。如氧化铝小柱可能带有碱性（因其中可混合有碳酸钠等成分），对于生物碱类等碱性化合物的分离颇为理想，但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。但随着各种SPE小柱的开发应用，目前也有一部分分析工作者认为，改良后的传统液液分配萃取技术仍具有十分优秀的净化效果。
近年来，随着新品种抗生素种类的增加以及一些非法使用的抗生素现象的出现，对于食品中残留未知抗生素的分析需求越来越高。许多情况下需要确定供试样品中可能会残留超标的抗生素的确切种类和具体名称，因此，高分辨质谱（HRMS）分析仪，如Q-TOF和Q-Orbitrap等被引入分析领域，用于非目标抗生素残留的筛选。液相色谱与高分辨率质谱联用（LC-HRMS）可用于量化痕量水平的抗生素残留，此外，可以同时对其转化产物或代谢物进行非靶向筛选。
Arsand等（2016）建立了一种液相色谱-四极杆飞行时间-质谱（LC-Q-TOF-MS）方法用于筛选牛奶以及牛、猪和家禽肌肉中的10种氨基糖苷类抗生素，并使用LC-MS/MS法进行定量分析。Vardai等（2018）开发了一种超高效液相色谱-四级杆飞行时间-质谱（UPLC-QTOF-MS ）方法，用于同时测定欧洲鲈鱼可食用肌肉和皮肤组织中常见的四环素类、喹诺酮类以及磺胺类等20种抗生素残留和代谢物水平。杨帆等（2021）建立了实时直接分析-高分辨质谱（DART-Q-Orbitrap HRMS）法快速检测了乳粉中16种常见的磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的筛查检测，筛查限浓度水平达到100 μg/kg。
代谢组学技术广泛应用于癌症研究或药物研发中的生物标志物的发现，但是近十多年来逐渐应用于兽药残留检测领域，为兽药残留分析检测提供新的研究方向，由于技术门槛以及费用较高，相关研究发表的文献较少。如Hermo等（2014）利用LTQ-Orbitrap质谱法进行阿莫西林的定量测定并对喂药后鸡组织中其代谢组学特征进行定性分析。Morales等（2015）对经过药物治疗的肉鸡肝脏、肾脏和肌肉组织中恩诺沙星代谢物的鉴定和分布进行研究，并定性分析了给药后这些组织中代谢谱的变化，结果共鉴定出来自恩诺沙星的31种不同代谢物，其中环丙沙星和去乙烯恩诺沙星为最主要的代谢物。郭旭茜等（2019）对代谢组学技术在兽药违规使用监测中的应用进行了综述，并以“瘦肉精”和类固醇两类违禁兽药残留检测为例，简述了代谢组学常用检测技术对动物血液、尿液等生物样本进行残留分析检测的应用现状。徐尤发（2017）研究了沙咪珠利使用后鸡内源性代谢物的变化，找出了主要生物标志物，揭示了沙咪珠利在鸡体内的作用机理。同时采用鸡肝肾微粒体和肝肾细胞鉴定了沙咪珠利在鸡体外的代谢产物，探究沙咪珠利在鸡体外的代谢机制。李勇（2008）研究了鸡体内兽药喹烯酮代谢组学，发现利用代谢组学技术可以区分服药组和对照组的代谢表型，认为该技术可以很好地应用于兽药残留研究，而且代谢组学分析能够很好地反映出用药后动物体内外源性代谢物的剂量效应和时间效应，还能够描述出内源性代谢物表型的改变。孙玲伟等（2014）对代谢组学平台在兽药检测中的研究应用进行了分析，认为在兽药残留检测样品分离、纯化技术及确证技术上代谢组学均具有良好的发展前途。但是，刘思洁等（2014）认为代谢组学技术在实际应用中依然存在一些问题有待进一步研究，目前代谢组学只能为食品安全风险监测与评估提供一定的参考。总的说来，代谢组学研究生物体系因不同条件因素而影响内源性代谢物变化，在食品中兽药残留、禁用物质、转基因食品、食品掺假和食源性疾病等检测方面都有着良好的应用前景，但相关具体应用技术还有待完善和提高。
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微生物法
微生物法是监测食品中抗生素残留分析中使用最早的检测方法。微生物测定原理基于所测抗生素对微生物生长的抑制作用，一般分为管碟法、纸片法（PD）和氯化三苯基四氮唑法（TTC）。PD耗资小，但容易出现假阳性；TTC在早期和现在的许多国内外官方标准方法中都有用到，例如，我国的GB/T 4789.27—2008中的第一法，但它和纸片法一样都容易出现假阳性。此外还有不常使用的Delvotest法等。利用传统微生物法进行动物源性食品中抗生素残留测定在该领域发展早期有较成熟的应用（见表2），现已基本被淘汰，偶用于养殖生产中抗生素残留的定性判断。
由表2可知，微生物检测方法的适用范围很窄，仅对少数种类的抗生素适用。因其容易出现假阳性结果，除非没有相应的仪器检测方法，一般现在很少再使用。目前所用的基质类型多为牛奶、蜂蜜这些流体基质，少量为肉类基质，肝、肾样品的检测中则鲜有报道。
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免疫测定法
免疫测定法的原理基于抗体和抗原之间的特异性反应。免疫测定法灵敏、精确且操作简单，由于其抗体的高特异性，该方法可以同时检测不同种类的药物。目前常用的免疫分析方法有酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光免疫检测方法（FIA）、胶体金免疫层析法（CGIA）以及免疫传感器分析法（ISA）等。免疫测定法已成为精确测定复杂基质中抗生素残留的仪器检测法和微生物法的替代或补充技术。跟色谱-质谱仪器方法相比，免疫测定法是以抗体结合等生物识别技术为基础的检测方法一般不需要样品的预浓缩和提取净化。
3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术，主要是以固相材料为载体来吸附抗原或抗体的一种免疫分析方法，已广泛用于抗生素残留的快速筛选测定。Minxuan等（2021）以头孢氨苄分子为半抗原制备了一种新型广谱抗体，并开发了间接竞争酶联免疫吸附分析方法（IC-ELISA）监测动物源性食品中4种头孢菌素-头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄和头孢唑啉的残留，回收率达到了72.3%~95.6%。Panzenhagen等（2016）用ELISA试剂盒检测了肉鸡组织中恩诺沙星残留量，并与LC-MS/MS方法进行对比，得出ELISA试剂盒检测快、价格低且实用性强的结论。
动物源样品中抗生素的酶联免疫检测方法示例见表3，由表3可知，近年来酶联免疫检测方法的开发和应用仍处于主流方向。从禁用抗生素及其代谢产物到大量使用的抗生素，以及新开发应用的药物都有相关检测研究报道。该类检测方法多开发相关试剂盒使用，检测方便快速，灵敏度高，可同时进行大批量样品的抗生素残留情况筛选。但该类检测方法可能存在假阳性现象，且阳性样品一般需要采用仪器检测方法进一步验证。
3.2 胶体金免疫层析法（CGIA）
GICA是集胶体金为显色媒介、利用抗原抗体特异性结合原理为一体的一种新型免疫学检测技术。GICA技术在动物源性食品中抗生素的残留检测领域已有大量应用。据相关文献报道，该技术已实现β-内酰胺类、四环素类、链霉素、呋喃妥因、氯霉素、螺旋霉素等在牛奶、鱼虾中的残留检测。GICA具有前处理简单、样品用量少、检测速度快等特点，适合大规模的快速检测，且更适合现场快速检测。Chao等（2020）将金纳米颗粒（AuNPs）掺入到传统的ELISA中来灵敏地检测呋喃他酮代谢产物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)，在优化条件下，信号放大ELISA达到2~10 ng/mL的检测限，在灵敏度上比传统ELISA提高了500倍。该方法成功测定了不同加标量AMOZ的猪肝样品，表明该信号扩增ELISA可作为测定各种食品中低分子量污染物的一般信号增强策略。
3.3 化学发光-酶联免疫法
化学发光-酶联免疫法是利用特定的酶标记抗原或抗体并与待测物进行酶联免疫反应后，由其化学发光强度测定待测物含量的一种新型免疫分析技术。化学发光法利用物质的化学发光特性进行测试，具有灵敏度高，分析方法简单快捷，检测时间短及诊断范围宽等优点，相对于常规酶联检测技术，化学发光-酶联免疫法获得的结果更准确。该方法在动物源食品抗生素的残留检测中得到不少研究和探索，但相关检测试剂盒商品的成功开发很少，这可能与为该检测技术的稳定性有待提高有关。李思等（2021）通过对盐酸沙拉沙星(SAR)进行分子改造和偶联蛋白合成完全免疫原，免疫小鼠制备SAR单克隆抗体，建立了IC-CLEIA检测方法，灵敏度IC50为1.45 ng/mL，SAR标准溶液的最低检测限（LOD）为0.32 ng/mL，SAR在鸡肉样品中的LOD为0.46 μg/kg，添加回收率在88.3%~106.7%范围内，其变异系数≤12.2%。李思等（2021）将沙拉沙星单克隆抗体（SAR-Ab）与辣根过氧化物酶（HRP）偶联得到酶标抗体（McAb-HRP），从而建立直接竞争化学发光酶联免疫（dc-CLEIA）检测方法。其灵敏度IC50为3.19 ng/mL，沙拉沙星和二氟沙星在鸡肉样品中的最低检出限分别为1.25、1.36 μg/kg，沙拉沙星和二氟沙星在鸡肉样品中的添加回收率分别为88.2%~108.3%、93.36%~102.7%，且其变异系数均≤13.4%。这两个方法分别可用于单一沙拉沙星、沙拉沙星和二氟沙星的残留检测。
3.4 免疫传感器分析法（ISA）
免疫传感器是一种新兴的生物传感器，将传统的免疫测试和生物传感技术整合，结合两者优点，从而减少分析时间、提高灵敏度和准确度。Fan等（2020）建立了基于双表面增强拉曼散射的侧向流免疫传感器，用于同时检测牛奶中的两种常见抗生素残留，包括四环素和青霉素；Minxuan等（2014）研发了一种创新的电化学免疫装置，基于应用金属硫化物纳米团簇的免疫测定能够在同一传感界面上同时测定四环素和氯霉素；Aleksandra等（2019）归纳了近年来用于动物源性食品中（蜂蜜、牛奶和鸡蛋）抗生素残留检测的电化学免疫传感器进展，包括对四环素、磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类以及阿奇霉素的痕量检测。
免疫传感器以高度特异性、敏感性和稳定性的特点受到广泛的青睐。且测定过程简单，易于实现自动化操作，减少了对使用者及环境技术条件的依赖，在现场或野外进行快速筛选测定方面具有广阔的应用前景。
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生物传感器法
生物传感器是食品中抗生素残留检测领域的创新工具，由两个主要部分组成：识别目标分析物的生物受体（敏感元件）以及将其转换为可测量信号的传感器（换能器）。其中敏感元件一般包括固定化的生物体成分（酶、抗体、抗原、核酸等）或生物体本身（细胞、细胞器、组织等）。生物传感器主要包括电化学生物传感器、压电生物传感器、光学生物传感器以及热生物传感器，前三者在抗生素残留检测领域的应用已有较多报道（见表4），热生物传感器暂未检索到相关文献。
由表4可知，生物传感器法基于不同的原理可分为多种类型，目前发表的文献多应用于牛奶、蜂蜜这些流质样品的检测，也有少数应用于虾、肉、蛋这些相对来说基质成分较为简单的固体样品（与肝、肾等样品比较）的检测。分析检测的残留药物种类还有很大的开发空间。
4.1 电化学生物传感器
电化学传感技术始于1950年初，电化学生物传感器可以通过使用电流、电位、阻抗或电导传感器来量化目标分析物；电化学生物传感器具有简单、快速、便携、易于制造、现场适用性和低成本等优点，无需样品预处理即可准确快速地响应，实现了使用直观设备进行现场分析。
4.2 压电生物传感器
压电生物传感器被认为是最灵敏的分析技术之一，其中石英晶体微天平（QCM）是迄今为止最受欢迎的压电生物传感器，它是一种无需标记即可检测生物分子的工具。电化学石英晶体纳米天平（EQCN）是在QCM的基础上发展起来的，近年来逐渐升温，用于监测连接在振动石英单晶上的工作电极质量的极小变化。Sunil等（2017）利用基于EQCN的监测系统对牛奶中磺胺嘧啶残留进行测定，发现这种生物传感器在检测水、废水和牛奶等各种基质中的抗生素残留方面具有巨大潜力。尽管具有潜力，但总的来说，压电生物传感器并未普遍用于抗生素残留的检测。
4.3 光学生物传感器
光学生物传感器是以抗体和酶等生物材料为感应元件，主要包括：荧光生物传感器、表面等离子体共振传感器、表面增强拉曼光谱传感器和共振瑞利散射光谱传感器等。光学生物传感器因其灵敏度高、检测速度快、操作简单等独特的优点为抗生素的残留检测提供了新途径。但是目前抗生素污染范围广、污染种类多、残留量低，且样品基质复杂，限制了光学生物传感器在实际检测中的应用与推广。
总之，生物传感器作为新兴技术不断地发展，用于筛选动物源性食品中抗生素残留的“理想”生物传感器应廉价、快速、易于使用且具有特异性，并且样品制备量小。现已有学者开发的生物传感器即使在低浓度下，也无需进行繁琐的样品预处理即可快速、灵敏地测定样品中的残留物。生物传感器的最新发展趋势之一是与纳米材料结合，从而显著提高其在灵敏度、选择性和检测响应速度方面的性能，实现低成本和高便携性。
一般来说，生物传感器可以算是微生物法的替代品种。微生物法成本低且操作简单，但是耗时长，稳定性差并且具有大量干扰因素，灵敏度较差，已逐渐被残留检测领域所淘汰；如今更高效、更经济的生物传感器逐渐被开发，研究已经确定了开发高效生物传感器的3个主要因素：生物识别元件、换能器和纳米技术。这些因素的进步对于开发新的生物传感器至关重要，尤其是纳米技术在生物传感器性能改进方面得到了巨大的关注。相关研究已有较多报道，Cunyi等（2020）开发了一种纳米纤维膜免疫生物传感器，纳米纤维的高比表面积显著增加了连接到纤维表面的抗体数量与传感器和样品中存在的抗原的结合能力，为现场检测的传感器开发提供了新途径；Zhang等（2016）报道了使用三维还原氧化石墨烯结构（3DRGOA）用于检测氯霉素的电化学传感器的开发，由于3DRGOA具有比表面积大和电子转移阻力低等特性，该传感器表现出更良好的选择性、稳定性和重现性。这3个领域同时取得进展的结合，将促进未来更廉价和更高效的生物传感器的研发，生物传感器也代表着动物源食品中抗生素残留物检测方法的未来。
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总结与展望
综上所述，动物源食品中抗生素残留检测的方法目前主流定量分析和确证分析方法为液相色谱-质谱联用法，主流快速筛选方法为酶联免疫吸附测定方法，多种原理的生物传感器方法将成为未来发展的高潜力技术。
参考文献及更多内容详见：
饲料工业，2022，43（20）：53-58
引用本文
赵军杰，程林丽，陈亚南，等. 动物源食品中抗生素残留检测方法进展[J]. 2022, 43(20): 53-58.
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