RT-qPCR

一、RNA提取（0.1g组织加1000μL Trizol、200μL氯仿，取得水相等体积异丙醇）

1）实验前准备

超净台 UV 30min照射、DEPC水（经DEPC——焦碳酸二乙酯处理过的，并经高压高温灭菌的超纯水）and 75%酒精提前灭菌、冰盒、酒精喷壶（灭菌）、EP管架、离心机预冷。

2）组织研磨并溶解

称取组织于冰上加入200μL Trizol用匀浆机研磨至肉眼不可见组织残渣。继续加入800μLTrizol混匀，室温静置5min使RNA溶解。

3）离心取上清

在4℃条件下，以12000r/min的转速离心10min，取上清于另一EP管中，弃去组织残渣。

4）相分离

上清液体中加入200μL氯仿，慢摇15s，室温静置5min。在4℃条件下，以12000r/min的转速离心15min，可见原上清分离三层现象。上层水相为溶解的RNA，中间白色乳状物为有机层，下部为所加试剂。

5）取水相并加入等体积异丙醇

小心吸取水相，于另一EP管中，按照与吸取水相等体积加入异丙醇。慢摇混匀，室温静置10min。

6）沉淀RNA并干燥

在4℃条件下，以12000r/min的转速离心10min，弃去上清留下沉淀，稍微干燥（风吹）。

7）清洗RNA

加入1mL 75%的酒精（4℃），沿着EP管壁加入，轻轻震荡。在4℃条件下，以10000r/min的转速离心5min，弃去上液（酒精溶液），干燥10min。

8）DEPC水溶解RNA并保存

以DEPC水溶解RNA，并转移至-80℃冰箱保存。

二、琼脂糖凝胶检测RNA含量

1）50×TEA缓冲液的配置

以称量Tris 242g，EDTA 18.612g于1L烧杯中； 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。（Tris-acetate提供导电性并可以保持pH值。EDTA通过螯合二价阳离子（Ca2+，Mg2+）来抑制金属依赖性核酸酶，从而在运行中保护DNA免受核酸酶的影响）

2）琼脂糖凝胶制备

将琼脂糖与TAE缓冲液以1g（琼脂糖）：100ml（TEA缓冲液）比例混合，置于微波炉中，一次沸腾即可（冒出大量气泡），倾倒于制胶模具中，30min凝胶，拔出梳子。在电泳槽中倒入TEA缓冲液（3次即可更换）将制得的胶置于中间平台边缘，加样品空朝向负极。

3）点样and加样

在封口膜/PE手套上点按照样品数目+1（梯度marker）次指示marker（指示整体RNA样品处于琼脂糖凝胶的位置相当于溴酚蓝功能），每次1μL，然后依次在每个点中点入2μL梯度marker/样品，吹打后加入琼脂糖孔隙中。

4）运行

设置电压120V运行大约40min，即当指示marker跑到琼脂糖凝胶3/4区域时，停止运行。

5）紫外显影

在显影仪中进行紫外显影。