逻辑不乱，文献不难。各位解螺旋学员大家好，我是晨星计划学员银杏，今天和大家一起学习的是一篇今年4月发表于Nature Communications（目前实时影响因子14.9分）上的非编码lncRNA加反馈环路文章。
上次的文献品谈会给大家讲解了一篇堪称绝绝子细胞间反馈环路的文章，这一次就选择了这样一篇分子间反馈环路的文章。
文献信息
【标题】AKRAS-responsive long non-coding RNA controls microRNA processing
【主变量】lnRNAKIMAT1
【疾病】非小细胞肺癌（从摘要中获得）
【表型】miRNA加工
（文章中共有3个表型：miRNA加工、肿瘤增殖、侵袭）
【机制】维持KRAS信号传导
基于文章题目和摘要，我们可以做出这样的科学假设：
在【疾病】中，【分子（主变量）】通过【机制】介导【表型】。
即在【非小细胞肺癌】中，【KIMAT1】通过【维持KRAS信号传导】调节了【miRNA加工】及【肿瘤细胞的增殖、侵袭】。
背景知识
知识点一：反馈环路
在酸菜校长的第34策《环环相扣》，他讲到了反馈机制研究的五个特点：
第一个特点：三元变量成环最佳。
既然是想把这个机制最后环成一个圈，那么在最开始设计的时候就要往这个方向去靠拢，而不是说找到主变量了之后，去往下找下游变量，再找下游的下游变量，然后发现下游的下游恰好就可以调控主变量，这种撞大运的形式发生的几率是非常低的。
所以，如果想要去设计这种反馈环路套路文章的时候，就应该下意识的去在下游分子里去找一些可能能圈回来的分子。
那么最佳的组合就是三个分子进行反馈环路的研究。如果要是两个分子的话，我能调节你，你也能调节我，这样发生的几率在其实在我们人体中相对来说是比较少见的。
而如果我们把它变成一个四元变量的反馈的话，那么他的论证步骤就会远远超过三元反馈成环的步骤，所以从最佳性价比模式来看的话，三元成环反馈是最佳的一种套路模式。
第二个特点：在这个环里也是有主变量和次要变量的。
那么主变量的话，酸菜老师建议我们最好将主变量放在整个环路的最上游，这样在我们论证的时候就可以主要集中于对于主变量进行论证，论证主变量和它下游的交互和它下游的下游的调控，以及，他下游的下游反过来如何调控主变量。
而对于它的下游和它下游的下游的这两个分子之间就可以相对来说省略一些论证步骤了。这是一种最佳的搭配模式。
不过，我们要学习这篇文章其实不是这么做的，我们到后面再说。
第三个特点：反馈环路的套路，它可以兼容一些其他的套路。
比如说分子嵌套、横纵嵌套或者细胞嵌套。我们可以在反馈环路套路中嵌套横纵嵌套，包括一些泛素化、甲基化之类的修饰。
细胞嵌套的话，我上次给大家讲过的那一篇细胞间反馈环路的文章，其实就是一个很经典的细胞间反馈的调控模式的研究套路。
其实在讲那篇文章之后，我后来又看到几篇肿瘤领域中，也是通过肿瘤糖酵解来调控细胞间交互的，然后发现其实这样已经是一个很成熟的套路了：在肿瘤细胞中，通过糖酵解可以调控乳酸的分泌，而乳酸可以调控肿瘤微环境中其他细胞的分泌。
那么这样的话就可以把肿瘤细胞和肿瘤微环境中的其他细胞连成一个环。
第四个特点：其中有一组二元的交互，可以采取简配的套路。
比如二元交互中最简单的miRNA或者是转录因子套路。
当我们一篇做了反馈环路这样复杂套路的文章的时候，我们其中的二元交互就可以不采取像蛋白蛋白交互这么复杂的交互用转录因子这样的。减配套路的话，可以节省一些工作量。
第五个特点：机制模式图。
这样机制相对来说比较复杂的文章，加上一个好看的机制通路图可以便于大家的理解。
知识点二：miRNA加工
miRNA也是由编码基因转录产生的。
最初转录出来的miRNA 称为初级转录产物（primarymiRNA，pri-miRNA），pri-miRNA在细胞核中通过Drosha核酸内切酶剪切加工产生miRNA前（miRNAprecursor，pre-miRNA）。
miRNA前体转运到胞浆再被Dicer 酶切产生miRNA成熟体。
在细胞核中还有一些配合Drosha核酸内切酶工作的蛋白，叫做microprocessorcomplex，按照直接翻译过来的话，应该是微处理器复合体。
我们可以把它理解成为一个辅助核酸内切酶进行miRNA加工的复合物，我们称之为MC复合物。
文章思路
文章的论证思路大体可以分为以下几部分：
第一部分：单变量论证主变量调控表型（Fig2、Fig6）
第二部分：主变量上游机制论证（Fig2）
第三部分：主变量的下游机制论证及反馈环路论证（Fig4、Fig5）
第四部分：动物实验验证（Fig8）
正文解读
图1：KRAS反应性lncRNA
图a：TCGA：KRAS高水平扩增，KRASmRNA表达量与KRAS拷贝数正相关
图b：KRAS扩增的LUAD及LUSC患者无病生存期DFS较差
图c：转染KRAS之后，差异基因的火山图
S1h：KIMAT1是非编码转录本
S1i、k：KRAS沉默降低了KIMAT1表达
S1l、m：KRAS上游或下游分子的沉默降低了KIMAT1表达
S2a-d：过表达KRAS增加了细胞增殖和 3D细胞侵袭，敲低KIMAT1后回复
图d：TCGAvs GTEx：KIMAT1是肺癌标本中表达最高的KRAS 调节的lncRNA 之一
图e：腺癌和鳞状细胞癌中，KRAS 和KIMAT1表达水平更高
图f：KIMAT1与KRAS表达正相关
研究非编码基因的小伙伴可能都知道，当我们想要做非编码RNA的时候，如果这个非编码RNA是我们第一次发现的，那么需要论证一下它是一个不编码的基因。
作者在这里通过软件计算它的编码能力，并且以KRAS和另外一个lncRNA作为对照来验证了本文主变量KIMAT1是一个非编码的转录本。
在Fig1中，作者筛选得到了KIMAT1这个lncRNA，并且对于主变量在肿瘤和正常样本中的表达差异进行了论证。
图2：KIMAT1由MYC转录激活
图a：基因表达测序（CAGE-seq）确定转录起始位点（TSS）
图b：在TSS 附近的MYC 结合水平增加，并与H3K4me3 和H3K27ac 峰重叠
图c：MER101LTRs包含两个 MYCBS
图d：MYC沉默降低了与 MER-101-1序列融合的报告基因的表达
删除两个 MYC结合位点荧光素酶活性回复
图e：ChIP-qPCR：MYC与KIMAT1启动子结合
图f：沉默MYC，KIMAT1 的表达降低
图g：敲除MYC消除了KRAS对KIMAT1的诱导
作者在这一部分论证了KIMAT1的上游是通过MYC进行转录激活的，通过荧光素酶报告实验和ChIP实验论证了MYC可以与KIMAT1启动子结合。
图3：KIMAT1是NSCLC中的致癌lncRNA
图a、b：smFISH、亚细胞分离实验：KIMAT1定位于细胞质和细胞核中
图c-e：沉默KIMAT1显着降低了细胞增殖、3D细胞侵袭，并诱导细胞死亡
图g-h：过表达KIMAT1后，3D细胞侵袭增强，小鼠模型中肿瘤体积增大
在36策中，酸菜校长也曾经讲过，如果我们研究的主变量是lnRNA的话，想对它的机制进行探索，首先要知道这个lnRNA的定位，是定位在细胞核，还是定位在细胞质？因为定位不同，可能介导的机制是不同的。
如果lnRNA的定位在胞浆的话，研究的两种主要模式就是ceRNA和RNA结合蛋白（RBP）这两种模式；
如果定位是在胞核的话，那么研究方向主要就是顺式调控作用、反式作用调控基因，singal、guide和decoy模式基本上都属于这种。
在这一部分，作者确定了lncRNA的定位，论证了主变量对表型细胞增殖、细胞侵袭的影响（单变量论证）。
图4：KIMAT1直接与DHX9、NPM1相互作用
图b：RNApull-down ：KIMAT1与DHX9 、NPM1的结合
图c、d：RIP
图e、f：KIMAT1/DHX9 和KIMAT1/NPM1 在细胞中的共定位
图g：KIMAT1与DHX9和NPM1结合片段
图h、i：DHX9dsRBD 和 NPM1DRBD 结构域缺失后，不能与KIMAT1结合
S5e：突变体的过表达产生较少数量的集落
图j、k：敲除DHX9和 NPM1 后，减少3D 细胞侵袭
图l：敲除KIMAT1后，可诱导DHX9和 NPM1 降解
在下游，作者找到了与两个与KIMAT1可能结合的蛋白，并且通过RNApull-down和RIP进行了验证。
对于RNA和蛋白的结合的论证，首先要证明他们有直接的结合（RNApull-down及RIP），此外，还要观察他们是否有共定位。
如果要进行更细致的研究的话，可以把RNA分为区段、蛋白分成区域来研究，具体是RNA的哪个片段结合到蛋白的哪个区域。
之后我们还可以对这些片段或者区域进行突变，来观察蛋白和RNA是否还能再次结合。
在这里作者论证了与KIMAT1结合的区域为DHX9dsRBD 和 NPM1DRBD 结构域。
图5：KIMAT1、DHX9、NPM1调节KRAS信号
图a：与正常肺相比，DHX9 和NPM1 在肺癌（LUAD和 LUSC ）中上调
图b：DHX9 和NPM1与KRAS和 KIMAT1呈正相关
图c：DHX9/NPM1/KIMAT1的高表达与肺癌患者的总体生存率OS较差有关
图d：RNA-seq：KIMAT1和DHX9 调节的基因及由KIMAT1和NPM1调节的基因存在显着重叠
图e：GSEA 分析：KIMAT1KD 后， KRAS正调控基因的抑制、KRAS 负调控基因富集
图f：KIMAT1 KD 后，KRAS、RAF和 MEK信号相关的基因特征下调
图g：敲减/过表达KIMAT1，检测KRAS靶基因表达变化
图h：敲减DHX9、NPM1后，检测KRAS靶基因表达变化
这张图是作者完成了对于反馈的环路的论证，将下游的DHX9/NPM1绕回到KIMIT1上游的KRAS的靶基因调控。
图6：KIMAT1调节miRNA加工
图a：NGS分析KIMAT1KD 与对照细胞相比的miRNA表达
图b：敲减KIMAT1后，成熟和前体miRNA 表达下降，初级miRNA 的表达保持不变
图c：KIMAT1KD 促进了 Drosha介导的pri-miR-27b体外加工
S11b：DHX9KO 对 miRNA生物发生的影响类似KIMAT1KD
S11c：与DHX9 一样，NPM1参与了 miRNA加工
图d：NPM1和 DDX5结合
图e：FLAG标签的DHX9与NPM1 结合
图f：DHX9和 NPM1在细胞核中独立于KIMAT1相互作用
在这一部分，作者论证了KIMAT1对于调节miRNA加工这个表型的影响，当敲除KIMAT1后，会影响Drosha介导miRNA加工，导致成熟和前体miRNA 表达下降。
在这里，作者还论证了NPM1、DDX5及DHX9可以两两结合，形成一个三元复合物。
图7：p21可拮抗 DHX9 和NPM1 对 miRNA加工的影响
图a：敲除KIMAT1后，MYC表达下调、p21表达上调
图b：p21KD 诱导致促癌 miRNA的显着上调和具有生长抑制功能的miRNA 的下调，前体miRNA 的水平发生了变化，而初级miRNA 不受影响
图c：免疫共沉淀：Drosha与p21相互作用
图d：p21OE 降低了促癌 miRNA与 DHX9/NPM1之间的结合
图e：p21OE 阻碍了 DDX5和 DHX9 之间以及DDX5 和 NPM1之间的结合
图f：p21OE 降低了 DDX5和 NPM1 蛋白，但不降低mRNA 水平
图g：p21OE显着诱导了细胞死亡
在MC复合物中，p21也可以调控miRNA加工，并且当p21过表达时，DDX5和 DHX9 之间以及DDX5 和 NPM1之间的结合均受到了抑制，即在MC复合物内，各分子间也存在相互拮抗的作用。
图8：（体内）沉默KIMAT1抑制肿瘤生长，过表达促进肿瘤发生和远处转移
图a：敲除KIMAT1显着抑制肿瘤生长
图b：敲除KIMAT1后，KRAS 和Ki67 蛋白水平下降
图c、d：KIMAT1OE 促进肿瘤发生并引起肝和肾转移
图e：DHX9KO 和 NPM1 KO降低了 KRAS表达和远处转移的数量
作者在动物模型中验证了KIMAT1对于肿瘤生长及转移的影响，单变量论证的动物实验部分（一正一反）。
范文总结
本文运用了很多实验方法，并从分子、细胞、组织、动物、临床五个层面进行分析。
对照机制图，再次来梳理一下本文的思路：
首先，作者探究的是当KRAS基因野生型的时候，KRAS基因的扩增对于下游通路的影响。
那么当KRAS基因扩增时候，我们可以看到它调控了MYC分子，而MYC分子可以结合KIMAT1这个lncRNA的转录起始位点进行转录调控。
KIMAT1这个lncRNA可以与两个蛋白直接结合，一个是核蛋白NPM1，另外一个是DHX9。
而DHX9和NPM1在细胞核中可以和Drosha这个内切核酸内切酶一起与DDX5这个蛋白结合，之后，对于促进肿瘤发生的一些miRNA和抑制肿瘤发生的一些miRNA进行调控。
KIMAT1、NPM1、DHX9这三个分子也可以对KRAS的表达进行进一步的调控。
全文论证非常丰富，工作量也很足：
单变量论证：主变量KIMAT1调控表型（Fig3、Fig6、Fig8）
上游变量论证：MYC转录调控主变量KIMAT1（Fig2）
下游变量论证：主变量KIMAT1与DHX9、NPM1直接结合（Fig4、Fig7）
本篇文章的优点还是非常突出的：在工作量上非常丰富，尤其lncRNA和蛋白进行交互的论证中，作者把这个交互论证，细化到了区段分析，并且还做了区段删除或者是突变这样的必要性操作。其实是给文章很加分的，但是工作量也是可以想象的大。
缺点的话，个人认为对于反馈环路这一部分的机制论证不够完整，而且作者所做的并不是一个我们所谓的最佳性价比套路，不是严格意义上的三元变量调控成环，所以文中的思路和设计也仅供大家参考和学习。
以上就是本次分享的全部内容，欢迎大家一起讨论学习~
本周品谈会直播预告
时间：12月3日 19:00
主讲人：Ella
主题：外泌体
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