【LorMe周刊】粘液——细菌与噬菌体长期共存的关键物质

作者：侯如娇，南京农业大学硕士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。 

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍裂解性噬菌体在具有抗性的粘液型细菌中能够维持的一般机制。原文于2020年发表在《FEMS Microbiology Ecology》上。

摘要

细菌与噬菌体长期共存的过程中，裂解性噬菌体如何在以细菌为主的群体中得以保留？有研究认为细菌在抵抗噬菌体侵染中产生的胞外多糖、粘液等发挥了作用。粘液对细菌和噬菌体共存的作用是什么？在什么情况下以及如何使产生粘液的细菌恢复到非粘液菌落的状态？本项研究采用连续转接培养试验，以粘液性大肠杆菌MG1655以及不同裂解性噬菌体为对象，通过种群动态和单菌实验以及数学模型假说和基因组分析，探究细菌与裂解噬菌体稳定共存的一般机制，讨论粘液型大肠杆菌普遍抗噬菌体的原因，以及导致粘液型大肠杆菌从粘液型向敏感型转变的遗传和分子机制。

主要结果

一、噬菌体侵染对粘液型大肠杆菌的筛选及其种群动态

首先，试验探究裂解性噬菌体在大肠杆菌MG1655中选择粘液型菌株的能力是否不同，以及这些噬菌体选择的粘液型菌株与噬菌体的相互作用是否不同。试验将野生型大肠杆菌MG1655分别与T3、T4、T5以及T7噬菌体共培养，每24小时将培养物以1:100的比例稀释接种到新鲜的LB培养基中，连续转接10代。T3、T4噬菌体在所有10次转接中都能够保留，在最终转接结束时分离到的主要细菌群为粘液型菌株（图1A、B）。所有使用T5的试验都导致噬菌体在出现细菌包膜抗性后灭绝（图1D）。T7噬菌体在其中一个细菌群中得到保留，其中粘液细胞是这个细菌的主要群体。在剩下的两个菌群中，既没有检测到粘液突变也没有检测到耐药突变，细菌和噬菌体迅速灭绝（图1D）。

图1 T3（A）、T4（B）、T5（C）和T7（D）噬菌体与野生型大肠杆菌MG1655的种群动态

试验设置三次重复，实线表示每次重复中的细菌密度（红色/绿色/蓝色）；虚线表示相应的噬菌体密度。

接下来继续探究了这些噬菌体在粘液菌群中维持的能力。用T3、T4、T5、T7噬菌体分别与噬菌体T7选择的粘液型细菌共培养。如图2所示，四种噬菌体均能在选择的粘液性菌群中维持，且细菌密度较高。即大肠杆菌中噬菌体选择的粘液型细菌对噬菌体具有广泛的抗性，并表明大量噬菌体和粘液型大肠杆菌共存是一种普遍现象，并不依赖于最初用于选择的噬菌体。说明不同噬菌体的粘液性选择能力或粘液性突变率不同。

图2 T7选择的宿主菌株粘液性大肠杆菌MG1655与噬菌体T3（A）、T4（B）、T5（C）和T7（D）的种群动态

二、噬菌体选择粘液型菌株的作用机制

进一步探究其中的机制，试验研究了大肠杆菌荚膜多糖可拉酸合成途径中的基因突变。结果发现胶囊合成调节器磷脂酶系统调节大肠杆菌中可拉酸胶囊的产生，通过该途径过量产生可拉酸可导致独特的粘液菌落表型，裂解性噬菌体通过这个途径选择出具有突变特征的粘液型菌株。为了了解粘液选择的动力学和粘液性在噬菌体维持中的作用，试图探究EPS受损的不产生粘液的菌株是否能够在连续转接期间维持噬菌体种群。为此，测试了Rcs信号通路中的两个基因敲除（ΔrcsB和ΔrcsF）菌株以及一个EPS操纵子（ΔcpsB）基因敲除菌株，所有这些菌株在胶囊合成中都受损。还测试了一株菌株（rcsC137ompC::Tn5），该菌株在RcsC中能够激活A904V取代反应，产生粘液，以确定通过已知机制简单诱导粘液性是否足以维持噬菌体（图3）。结果表明T4、T7噬菌体在某些条件下会导致细菌种群崩溃，但在有些条件下不会，这在很大程度上取决于是否发生了包膜抗性进化；而T5噬菌体不管粘液性如何都在菌群中得以保持。

图3 粘液性的存在或缺失影响大肠杆菌-噬菌体相互作用的动力学

无噬菌体为对照（黑色和紫色线），红色和蓝色实线表示细菌密度（A），而虚线表示相应的噬菌体密度。

三、噬菌体在粘液菌群中维持的假说及验证

粘液型菌群对噬菌体有抗性，那么噬菌体是如何在粘液菌群中得以维持的？本文提出假说：在有抗性的粘液型菌群中保持高密度噬菌体可归因于从粘液状态到非粘液状态的高速转换所产生的大量敏感细菌，这一机制被称为“泄漏机制”。构建数学模型进行模拟，追踪了噬菌体和敏感细菌共培养转接处理中细菌和噬菌体群体密度的变化（图4A、B），粘液细菌主导的种群中细菌和噬菌体密度的变化（图4C-F）；在图4A中的模拟开始时，有10⁶个噬菌体，10⁷个敏感细胞，一个粘液细胞，没有抗性突变体。在第一次转接中，粘液型细菌成为优势种群，到第三次转移时，细菌和噬菌体的种群处于平衡状态。如果粘液不存在且不能产生，但存在抗性突变体，则它们将上升为优势菌株，噬菌体将灭绝（图4B）。为了更好地了解粘液细菌维持噬菌体所需的条件，模拟了将噬菌体引入粘液型菌群的情况。在这些模拟开始时，有10⁶个噬菌体，10⁷个粘液细菌，单个敏感和耐药细胞。结果表明粘液型细菌和敏感细菌之间的转换速率在这些动力学中所起的关键作用。当转换速率为10^-3时，噬菌体在粘液细菌为主的群落中建立了稳定的种群（图4C），当转换速率为10^-4时，噬菌体能够维持，但其密度在细菌和噬菌体数量稳定之前波动（图4D）。当转换速率为10^-5时，噬菌体密度的波动更大，基本无法稳定（图4E）。如果吸附速率为10^-10，则噬菌体无法维持，且抗性菌群上升，占菌群的主导地位（图4F）。

图4 敏感细菌、粘液细菌和抗性细菌与裂解噬菌体共培养转接实验中种群动态模拟结果

为了控制粘液细菌和维持噬菌体数量，噬菌体对粘液型细菌的吸附速率必须较低，从粘液型到敏感型的转化率很高。试验验证了这个假说，T3和T7噬菌体选择的粘液型和rcsC137组成性粘液突变体的处理中，检测了噬菌体密度、细胞密度的变化，并跟踪了实验过程中产生的溶原和非粘液（敏感）细胞（图5A-C），结果表明，在所有菌株的生长过程中，从粘液型到非粘液型的转换经常发生。此外，对噬菌体分别与粘液和非粘液菌群共培养中的单菌进行研究，使用一种编码Rcs表达荧光基因的质粒来观察最初粘液菌群中的异质性。结果发现粘液细胞和非粘液细胞在单菌水平上的形态没有明显的不同，然而，Rcs启动子的荧光表达在野生型和粘液型之间明显不同。在MG1655野生型非粘液菌群中，Rcs（红色）的表达较低，T7噬菌体侵染（绿色）普遍存在。而在T7诱导的粘液菌群中，Rcs表达较高，只有少数低Rcs表达细菌被T7噬菌体侵染。（图6）。

图5 溶原形成的短期种群动态

总细胞NT（黑色）、噬菌体P（红色）、溶原L（紫色）和敏感非溶原S（蓝色）。DS、ES和FS是模拟结果，用于解释A、B和C中的实验数据，从粘液型到敏感型的转化率不同。

图6 Rcs通路诱导与T7噬菌体感染呈负相关

总结

本文探究了噬菌体在菌群中长期保存的机制，研究表明当大肠杆菌的连续转接种群面对部分裂解噬菌体时，粘液型细菌上升成为优势种群。粘液型细菌对多种裂解噬菌体具有抗性，粘液提供的抗性是一般性的而不是特异性的。噬菌体可以在这些粘液菌群中维持，其中机制是细菌从耐药粘液状态向易感非粘液状态的高转化率。本研究为解决关于细菌和噬菌体的生态学、种群和进化生物学，噬菌体如何在细菌群落中维持这些问题提供了一个新的、全面的思路。

论文信息

原名：Mucoidy, a generalmechanism for maintaining lytic phage in populations of bacteria

译名：粘液性——在细菌种群中维持裂解噬菌体的一般机制

期刊：FEMS Microbiology Ecology

发表时间：2020.08

通讯作者：Bruce Levin

通讯作者单位：埃默里大学生物系