作者：万文，南京农业大学硕士在读，主要研究铁载体介导的植物与根际微生物的互作关系
植物的根系上定殖着不同的微生物群落，众多研究表明，这些微生物群落对植物的生长起着重要作用，解析这其中的具体机制对促进植物生长具有积极意义。本文研究发现在缺铁条件下，拟南芥根系能够通过分泌香豆素影响拟南芥与其根系微生物群落之间的相互作用。当根系分泌香豆素途径遭到破坏，会直接改变根系微生物群落，进而影响根系微生物群落与植物的相互作用，不利于限铁条件下植物的生长。因此，本文提出由香豆素的分泌可影响根系微生物群落，而这些微生物群落是植物适应限铁环境不可或缺的介质。
为评估限铁条件下香豆素对植物生长作用，作者在两种生物可利用性铁含量不同的土壤上（CAS呈微酸性，pH 6.5，生物可利用铁多；IS呈碱性和钙质，pH 7.5，CaCO3含量9.7%，土壤总铁高，但生物可用铁少）种植Col-0野生型拟南芥（WT）和香豆素合成、分泌受阻的突变拟南芥来比较不同物质对植物利用铁的差异（图1A）。一段时间培养观察到在IS上生长的f6'h1（香豆素前体东莨菪碱合成受阻）和s8h（香豆素前体秦皮素合成受阻）植物叶片鲜重（SFW）和叶绿素含量降低，在CAS上生长的WT和突变株在SFW和叶绿素含量上无差异（图1B、C）。在IS上生长的f6'h1出现生长缺陷，补充铁剂可改善这一现象，说明香豆素生物合成对于缺铁土壤中植物的生长至关重要。然而，pdr9（香豆素转运蛋白缺失）在CAS和IS上的生长与WT无差异，表明依赖于PDR9分泌的香豆素对缺铁条件下植物的生长并不重要（图1）。
通过基因扩增子测序，在扩增子序列变异(ASV)水平对不同土壤上生长的植物根际微生物群落进行分析。在无植物土壤和种植野生型、突变株根际土样中，IS的α多样性高于CAS。利用限制性主坐标分析对不同的拟南芥突变株和不同土壤类型的β多样性分析显示f6'h1和s8h在IS上生长时与其他突变株显著分离，在CAS上没有类似结果（图1D）。结果表明香豆素的生物合成，尤其是东莨菪碱和秦皮素，对于缺铁土壤中植物的生长的根际微生物群落组成很重要，富铁土壤中不然。这说明不同的土壤和不同基因型的植物间的相互作用可以作为根际微生物群落结构的决定性因素，解释了27.7%的群落变异（图1D）。
为了探究观察到的群落结构变化的本质，作者将不同土壤中种植的四种突变株与WT相比，对比ASV在不同突变株处理中的差异富集(deASV)。在f6'h1中观察到的deASV数量最多，在IS生长的植株中检测到的deASV数量显著多于CAS（IS中260个deASV，CAS中50个；图2A），就相对丰度而言，在IS生长的f6'h1中，deASV对菌群结构的相对丰度影响最大。
分类学分析显示，与检测到的ASV的完整列表相比，IS中f6'h1植物的deASV子集中多个细菌科的代表性显著升高或降低（图2B）。Burkholderiaceae是在deASV中检测到的最普遍的科，但在缺乏香豆素的植物中，其相对丰度没有显着改变（图2C）。排在受影响第二第三的Streptomycetaceae和Rhizobiaceae的相对丰度在IS上的f6'h1中显著改变。这表明，在ASV水平上，香豆素生物合成影响多个根际细菌科，但对较高分类等级的微生物群结构的影响较小，说明细菌科中存在ASV水平的补偿机制，在根际微生物群落建立期间，这些机制在缺铁土壤上且无香豆素产生的植物中保持较高的分类结构。与CAS相比，在IS中生长的s8h植物deASV数量有所增加（图2A），s8h deASV的分类学特征同样也表现为Burkholderiaceae数量较多，表明东莨菪碱和秦皮素都会影响根际微生物群落。
为了评估缺铁条件下根际微生物对植物的影响，研究采用琼脂培养基的无菌体系，并设置富铁（补充有效铁FeEDTA）和限铁（碱性条件下添加FeCl3最终形态为Fe(OH)3（unavFe））两种条件。作者先从CAS中生长的拟南芥根际分离细菌，设计了一个115个细菌组成的合成菌群（图3A），在限铁条件下植物出现生长缺陷和叶片萎黄的现象（图3B、C），添加合成菌群后大大提高植物的SFW和叶绿素含量。当富铁处理中铁的供应量减少到1 mM FeEDTA以下，未观察到合成菌群对植物生长促进作用（图3C）。为探究不同属的细菌对改善缺铁植物生长的能力，在限铁条件下分别单独添加53株细菌至植物根际（图3A，红色箭头）。结果中观察到了缓解植物生长缺陷的菌株以及缺乏这种能力的菌株（图3D），证明了这一现象的普遍性以及不同细菌的特异性。缺铁条件下，细菌群落可促进植物生长，且存在功能冗余。
作者利用拟南芥突变株来确定限铁条件下这些基因在合成菌群恢复植物生长中的重要性。fro2、irt1（均影响铁还原）表现出更为严重的生长缺陷和叶片萎黄（图4），与WT相比，添加合成菌群无法改善这些突变体的表型，甚至irt1 SFW进一步降低。在unavFe生长条件下，bts（铁胁迫反应的负调控因子缺失）比WT生物量更大且不褪绿，并且在接种合成菌群时略有改善植物生长。然而，在aha2（影响根际酸化）没有观察到类似现象，这说明在碱性条件下，植物根际酸化并不是合成菌群恢复植物生长的限制因素。
接下来作者研究在限铁条件下香豆素在合成菌群恢复植物生长中的作用。在unavFe上添加合成菌群对f6'h1、s8h、pdr9的生长没有帮助（图5）。相比之下，添加合成菌群有益于cyp82c4（秦皮素无法转化为香豆素）的生长。这些数据表明东莨菪碱和秦皮素的生物合成与分泌是限铁条件下合成菌群恢复植物生长所必需的，而香豆素（Sidretin，香豆素中的一类）是可有可无的。为进一步验证这两种物质的作用，作者将每种化合物补充于培养基中培养f6'h1（图6A、B）。添加东莨菪碱没有改善植物生长，而添加秦皮素的完全恢复了f6'h1的生长，此外，通过同时补充东莨菪碱和秦皮素，合成菌群也可以恢复s8h的生长（图6C）。这证实了秦皮素是合成菌群恢复植物生长必需的香豆素结构类型。
图4 SynCom通过还原铁的吸收恢复植物生长
本文通过测定叶片中铁元素含量来确定所观察到的植物缺铁现象以及添加微生物能否改善植物铁营养。在unavFe培养时接种合成菌群于WT中，促进植物铁吸收，并达到avFe培养时铁水平。为验证这一现象可能是因为微生物刺激或是接种合成菌群后增加了铁可用性，作者对无菌体系中生长的两个不同铁处理下的接种与不接种合成菌群的WT和f6'h1，共8个处理的全根转录组进行了分析。通过PCA对转录组分析（图7B）显示，铁含量是否充足是植物生长差异最大决定因素（PC1，18%），其次是有无添加合成菌群（PC2，9%）。当在avFe上生长时，WT和f6'h1数据未分离，但接种合成菌群后数据分离。这表明当铁可用时，接种合成菌群可以影响宿主植物的转录反应，与植物香豆素的分泌无关，但在unavFe上生长的植物的转录组与在avFe上生长的植物的转录组不同，突变株和接种合成菌群的结果进一步分离。当接种热灭活的合成菌群时，unavFe上的WT和f6'h1均与avFe簇（左上象限）分离。当在unavFe上接种活的合成菌群时，在Col-0和f6'h1植物之间观察到更显著的分离。在unavFe上接种活合成菌群的WT植物与avFe（右下象限）上的合成菌群接种的WT植物紧密聚集，而f6'h1植物留在左下象限，与avFe簇明显分开。这种模式表明，在f6'h1中对unavFe长的转录反应比WT更明显。
本文再根据表达模式对所有转录本进行k均值聚类，并确定差异表达基因以研究铁可用性、合成菌群和植物基因型之间的相互作用（图7C）。簇4表明该基因在无菌生长的WT和f6'h1植物中被诱导，并在f6'h1中强烈诱导这些基因，这些基因在接种合成菌群后在WT中降低到稳定，但在f6'h1中保持升高。基因分析显示，该簇属于缺铁反应、铁稳态和金属离子转运的基因（图7C，热图右侧的注释）。簇8中的基因显示出相反的结果：在unavFe处理中下调并在接种合成菌群的WT中恢复。在缺铁诱导的12个基因中，11个在簇4中，而在缺铁下被下调的13个基因中有7个在簇8中。香豆素生物合成基因显示，这些基因以基因型依赖的方式对铁和合成菌群有反应。这表明，与植物铁吸收的生物刺激不同，铁营养可以通过添加微生物群落来改善的，这意味着存在一种依赖香豆素和微生物群的机制，通过铁营养改善植物生长。
缺铁土壤极为普遍，缺铁导致植物生长滞缓、产量降低，严重制约了农业生产。本研究表明，在限铁条件下，植物根系分泌的香豆素化合物是有植物-微生物群落间有益相互作用的重要媒介。这类特殊的代谢物改变了根系微生物群落的组成，进而影响植物生长，是微生物群落介导植物铁吸收所必需的。
论文信息
原名：Root-Secreted Coumarins and the Microbiota Interact to Improve Iron Nutrition in Arabidopsis
译名：根系分泌物香豆素与微生物群落互作改善拟南芥的铁营养
期刊：Cell Host & Microbe
发表时间：2020.12.09
通讯作者：RubenGarrido-Oter、Paul Schulze-Lefert
通讯作者单位：德国科隆马克思普朗克植物育种研究所植物与微生物互作中心
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