【LorMe周刊】土壤细菌和原生动物互作促进丛枝菌根真菌对有机氮的利用

作者：刘龙飞，南京农业大学土壤微生物与有机肥团队硕士在读。主要研究原生动物与微生物互作对植物健康生长的影响。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍原生动物与细菌互作促进丛枝菌根真菌菌丝对有机氮的利用，原文于2021年发表在《The ISME Journal》上。

导读

丛枝菌根 (AM)是土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体，一直以来备受人们关注。研究发现丛枝菌根真菌（AMF）的胞外酶难以帮助其直接迅速的获得土壤中的有机养分，但研究表明它不仅能获得并且还能够向宿主植物提供足够的氮、磷养分，这可能是由于AMF与其他土壤微生物合作，共同担负起了吸收利用养分的重担。

通过现有现象的总结，作者提出了三个假说：①AMF菌丝虽然能产生几丁质酶和脱氨酶，但与以铵离子形式施用的氮相比，其并不能从有机氮源中直接获取氮；②在无根区接种几丁质分解细菌会增强AMF菌丝对于氮的吸收；③向无根区接种原生动物能进一步提升几丁质释放氮的速率，从而提高AMF菌丝对于氮的吸收量，并最终将其转移到根部。作者通过分室离体培养系统和单菌培养的方法，对有N15标识的几丁质（一种有机氮源）的循环利用进行观测，设计了以菊苣根、各种土壤细菌和多种原生动物为研究对象的实验，对提出的以上三个假设进行了研究和探讨。

主要结果

1

实验1：检验AMF利用几丁质中氮的形式和方式，验证细菌是否能促进AMF对氮的吸收利用

为了验证上述假说，作者设计了一个非常巧妙的实验装置，该系统使用一个大的培养皿（直径150 mm，高20mm）构建。在该培养皿中，一个小的 “根孔”（培养皿，直径60mm，高8 mm，带有一个用于根部转移的孔，用42 µm 尼龙网（由蓝线表示）与其余部分隔开）包含Ri T-DNA转化的菊苣根，非菌根或菌根（A）。菌根真菌菌丝通过网孔从菌根中生长出来，定植在填充大培养皿体积的MSR培养基中（B），并最终到达标记室（C）。标记室由另一个小培养皿制成（直径60 mm，高8 mm，边缘在大培养皿中的培养基表面上方突出至少1 mm，从而构成扩散屏障），并嵌入MSR培养基来填充大培养皿。标记室填充有改良的（无氮）MSR培养基，添加或不添加各种¹⁵N标记的氮源、细菌或原生动物。这个实验系统在保留了菌根的完整性的同时，设置了三个分区，模拟了野生状态下菌根的生存状态，提高了实验结果的可靠性。

图1 本研究采用的实验系统

表1 本研究中使用的细菌菌株的特征和来源

尽管最近有报道在几种AMF物种的基因组中发现了几丁质酶基因，但作者通过同位素分析发现AMF菌丝自身无法吸收并利用几丁质中的大量氮。另一方面，无论是否向培养基中添加了原核生物，AMF的菌丝都可以从标记隔间吸收大量铵离子并将其运送到根部。作者还观察到一些几丁质分解细菌的存在确实能存在确实能够促进AMF菌丝对于几丁质中氮的利用：在该种细菌存在的情况下，AMF从几丁质中获得的氮量是其他任何细菌的数倍。

图2 实验一中¹⁵N在接种了不同细菌的根以及附着在根上的菌根菌丝中的转移率（M+，菌根;NM，非菌根）

实验中Paenibacillus sp.中的两株几丁质分解菌株能够明显提高AMF对几丁质中氮的利用，并且它们的作用程度和时间动态各不相同。初步推测时间动态的不同是由于¹⁵N在标记室外根系和AMF菌丝的分配存在差异，作用程度的不同的原因还需要进行后续的研究。此外，并不是所有能分解几丁质的细菌都有这个功效，例如Janthinobacterium sp.，它在单独培养时确实能够利用几丁质中的氮，但在和AMF菌丝共同培养的情况下，它会优先利用AMF的复杂分泌物，而不是去分解几丁质。

图3 实验一中几丁质内的¹⁵N在标记室中向根（灰色条）或无根区的菌根菌丝（黑色条）的转移速率

2

实验2：检验向含有植物根、AMF和细菌的实验系统中加入原生动物能否提高AMF菌丝对于有机氮的利用率

实验二在实验一的基础上做出了改进，去除了可能会对一些细菌的生长产生干扰的蔗糖，设置了182个实验微域，每个培养基都装有 15 mL不含蔗糖的无氮 MSR 培养基，并用0.3% Phytagel 固化。每个标记室含有15 mg ¹⁵N标记的几丁质，与填充大板的培养基中的氮浓度相对应。然后，培养皿培养26天，以便在菌根处理中AMF菌丝对标记区进行有效定植。随后将制备的1×60 µL新鲜（4天龄）的菌悬液或无菌溶源液作为菌悬液加入或不加入到标记室中。在黑暗、 24 °C条件下再培养13 天。随后，在标记室中接种细菌的斑点上接种或不接种在各自细菌的培养物中产生的原生动物P.pallidum的胞囊，但ID8和13的细菌除外（培养液中不存在原生动物胞囊）。所以这两种细菌则用与细菌ID2共培养时形成的原生动物胞囊。然后在收获前将板在黑暗中在 24°C 下再培养9 天。

实验二证明，原生动物确实能加快AMF从几丁质中获取氮的速度。当一种真核生物捕食者（原生动物）与有机氮区中的原核生物一起存在时，能加快AMF菌丝从几丁质中获得氮的速度。

与实验一的结果相结合，作者向有Paenibacillus sp.存在的AMF中加入该原生动物，与未添加原生动物的相比，AMF从几丁质中获得的氮量进一步增加了至少 65%。

此外，在实验二中作者还注意到原生动物种群数量的变化取决于细菌种类，而且几丁质矿化速率和氮从几丁质转移到 AMF菌丝的速率不一定是一致的，因此，需要对AMF菌丝中有机氮循环的机制和途径进行深入研究。

图4 实验二中几丁质内的¹⁵N在标记室中向根（灰色条）或无根区的菌根菌丝（黑色条）的转移速率

结论

本研究中，作者通过大量的实验样本，证明AMF自身无法自行吸收并利用几丁质中的大量氮，主要是吸收以铵和硝酸盐离子形式存在的氮；一些能分解有机氮的细菌比如能分解几丁质的类芽孢杆菌能够辅助AMF利用有机氮；在此基础上添加原生动物，能够极大的提高AMF从几丁质中获取氮的速度。该研究证明了微生物之间的互作对AMF高效利用有机氮发挥了重要作用，但丛枝菌根（AM）复杂的生物环境注定了对其的研究还有很长的路要走，如AMF群落资源的化学计量、种间相互作用的时间动态以及种群动态都有待继续研究；此外，实验能否对野外的实际环境更进一步的模拟？在其他生态环境（如草原、农田）中，是否有其他的原生动物占据了主导地位？相信此类研究能在以AMF共生为主的有机养分循环型生态系统中大放异彩。

论文信息

原名：Organic nitrogenutilisation by an arbuscular mycorrhizal fungus is mediated by specific soilbacteria and a protist

译名：丛枝菌根真菌对有机氮的利用是由特定的土壤细菌和原生生物介导的

期刊：The ISME journal

DOI：10.1038/s41396-021-01112-8.

发表时间：2021.09

通讯作者：Rozmoš Martin

通讯作者单位：Laboratory of FungalBiology, Institute of Microbiology, Czech Academy of Sciences, Vídeňská 1083,14220, Prague, Czech Republic.