【LorMe周刊】描绘一类丝状真菌中与碳源利用相关的调控和转录因子

作者：陈培杰，南京农业大学博士在读，主要研究秸秆降解菌基因组挖掘。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍丝状真菌粗糙脉孢菌通过复杂而精密的调控网络实现植物生物质的高效降解利用。原文于2020年发表在《PNAS》上。

导读

丝状真菌，如粗糙脉孢菌Neurospora crassa，通过分泌一系列的植物细胞壁降解酶（PCWDEs），实现植物生物质成分的高效分解、运输和细胞内利用。尽管参与植物生物质分解的一些酶和转录调节因子已经明确，但目前对丝状真菌N. crassa如何感知环境中的碳源并调控植物细胞壁降解酶编码基因的表达以实现对复杂碳源的最佳利用还知之甚少。作者分析了N. crassa在40种不同碳源上的转录组，研究真菌如何感知从简单到复杂碳的水化合物，并确定了与碳源感知和转录调节有关的调节因子。使用体外DNA亲和纯化测序（DAP-seq）技术对参与调控PCWDE编码基因的转录因子进行分析，更全面地分析了参与调控PCWDE编码基因表达的转录因子以及这些转录因子之间的串扰。

主要结果

01

N.crassa 碳代谢受不同碳源的调节

在低浓度下，各种单糖、二糖和寡糖会诱导PCWDE编码基因表达。纤维二糖、麦芽糖、木糖和阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸分别诱导了编码纤维素酶、淀粉降解酶、半纤维素酶和果胶解构酶基因表达。然而，单独的一种糖也能够诱导水解其他单糖多聚物的PCWDE编码基因的表达，比如纤维二糖诱导一些编码某些木聚糖酶和果胶酶基因表达。这表明糖传感途径之间代谢串扰以及调控网络中的重叠。此外，N. crassa 还显示出对复杂植物生物质底物的强烈转录反应。为了评估协调PCWDE编码基因表达调控途径之间的串扰，作者采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了28个共表达基因模块，这些模块显示出特定的富集功能分类。大多数PCWDE编码基因存在于三个模块中。模块1（图1B红色；n = 153）包含编码PCWDE的基因，这些基因以及转录因子xlr-1、clr-1、clr-2、hac-1、ndvib-1响应纤维素和半纤维素显著上调。模块2（黄色；n = 42）包含大部分预测的果胶代谢基因。模块3（蓝色；n = 42）包含许多戊糖分解代谢基因以及一些木聚糖酶和木糖转运蛋白编码基因。另一个模块（模块4；n = 142；午夜蓝）与模块1和3紧密聚集在一起，ΔNCU04295该模块显著富集了与编码纤维素酶和木聚糖酶的基因共同调节的编码内质网（ER）的基因和蛋白质加工蛋白基因。

图1 N. crassa转录组跨碳源的层次聚类和共现网络分析。（A）转移到指定碳源的细胞中PCWDEs编码基因的归一化计数（FPKMs）的层次聚类。每个基因有不同的FPKMs范围。（B）共表达网络，节点代表按模块着色的基因，边缘代表具有相关表达谱的基因。

02

界定PCWDE编码基因转录调控网络

作者通过比较野生型和转录因子缺失突变株的转录组找到了两个在调节PCWDE编码基因表达过程中起着一致而明显作用的转录因子NCU04295和NCU05414。NCU04295的表达与编码果胶降解酶的基因聚类在一起。与野生型相比，ΔNCU04295突变株在富含果胶的柑橘皮上生长时，利用果胶所需基因的表达水平降低。NCU04295的预测蛋白质序列与GaaR具有相似性（约50%氨基酸同一性），GaaR在灰霉菌B. cinerea和黑曲霉A. niger中参与半乳糖醛酸代谢。因此，作者将其命名为NCU04295 pdr-2（果胶降解调节器-2，pectin degradation regulator-2）。Δpdr-2突变体在以果胶或半乳糖醛酸作为唯一碳源的培养基中表现出严重的生长缺陷，且果胶酸酶和内聚半乳糖醛酸酶的活性显著降低，这与其预测的功能一致。先前在N. crassa中发现的第二种果胶降解调节因子pdr-1，其缺失突变子也显示出在果胶上的严重生长缺陷。然而，与Δpdr-1突变子不同，Δpdr-2能够在以L-鼠李糖作为唯一碳源的培养基上生长，表明PDR-2和PDR-1在调节果胶降解中起着不同作用。

图2 转录因子prr-2调控果胶降解以及转录因子ara-1调控阿拉伯糖的利用。（A）在富含果胶的培养基上，∆NCU04295（prr-2）相对于野生型的差异表达分析，PCWDEs为黄色，糖转运体为紫色。（B）PCWDEs的差异表达量。（C）∆pdr-1、∆pdr-2和∆pdr-1 ∆pdr-2突变体相对于野生型的果胶酸酶和（D）内聚半乳糖醛酸酶的活性。（E）在芒草为碳源的培养基上，∆NCU05414（ara-1）相较于野生型差异表达分析，黄色的是PCWDEs，紫色的是糖转运体。（F）在对应的碳源中培养的∆ara-1突变株相对于野生型的生物量。（G）Δara-1和ara-1过表达菌株在阿拉伯糖碳源中培养时ard-1相较于野生型的表达。

NCU05414在芒草上培养时表现出高表达。而与在1%芒草上生长的野生型相比，ΔNCU05414突变体在利用阿拉伯聚糖、阿拉伯糖和半乳糖方面存在缺陷。正如预测的一样，ΔNCU05414菌株在2%阿拉伯聚糖、阿拉伯糖和半乳糖上的生长显着降低。当将NCU05414置于组成型强启动子Pgpd-1的调控下时，突变子在阿拉伯糖上的生长好于野生型且ard-1的表达也出现上调，进一步表明NCU05414对阿拉伯糖代谢基因的正调控。NCU05414预测的蛋白质与里氏木霉T. reeei和稻瘟病菌M. oryzae中的Ara1蛋白具有显著相似性，在阿拉伯糖代谢和阿拉伯糖和半乳糖分解代谢中发挥作用。因此，作者将其命名为NCU05414 ara-1。

许多参与降解混合底物（如果胶和半纤维素）的PCWDE编码基因受多种转录因子的调控。作者通过鉴定缺失突变子Δclr-1、Δclr-2、Δxlr-1、Δpdr-2和Δara-1的表达量至少下调了2.8倍的PCWDE编码基因，构建了它们的转录因子调节子CLR-1、CLR-2、XLR-1、PDR-1、PDR-2、ARA-1和COL-26，这些转录因子的调节子显示出广泛的重叠（图3）。

图3. N. crassa中主要PCWDE调节因子的重叠调节区，展示了转录因子（红色）对分解代谢CAZymes的正向调控。最外层是根据CAZymes的功能分组。Ar：阿拉伯糖；Ar.cat.：阿拉伯糖分解；β-glu：β-葡萄糖苷酶；β-m：β-甘露糖酶；Pec.cat：果胶分解；PMO：多糖单氧酶；Xy：木糖。每个CAZyme都由其基因ID代表。每条线代表野生型和转录因子缺失突变体之间表达明显不同的基因。线条的粗细对应于转录因子缺失突变体与野生型相比的变化程度，线条越粗表示变化越大。

03

DAP-Seq表明存在有CRE-1介导的碳源代谢抑制的多层次系统

CRE-1是丝状真菌中常见的碳源代谢抑制因子，DAP-seq的数据表明CRE-1可以直接或者间接地抑制PCWDE编码基因的表达。sut-28是一种糖转运蛋白编码基因，会与CRE-1结合。实验数据显示Δsut-28突变株无法吸收L-鼠李糖，在L-鼠李糖和聚半乳糖醛酸上的生长减少，与Δpdr-1突变体类似，Δsut-28突变株不能激活负责鼠李糖分解代谢的L-鼠李糖脱水酶编码基因表达。与野生型相比，当暴露于果胶和葡萄糖时，Δcre-1突变株显示出对L-鼠李糖的吸收量增加。这些数据表明CRE-1对sut-28的表达有负向调节。

CRE-1还能与纤维糊精转运蛋白编码基因cdt-1、cdt-2以及sut-12/cbt-1的启动子结合。缺乏cdt-1和cdt-2的细胞不能激活纤维素分解基因转录，也不能在纤维素上生长。CRE-1与clr-1的启动子结合可能导致了CRE-1抑制纤维素分解基因，因为CLR-1正向调节clr-2，而clr-2是N. crassa中纤维素分解基因的主要调节因子。

因此，这些数据表明CRE-1通过与糖转运蛋白、转录因子和一些PCWDE编码基因的启动子直接结合来抑制纤维素分解基因的表达。

图4 野生型和Δcre-1突变株中sut-28的表达和鼠李糖运输活性。（A）在果胶、鼠李糖和聚半乳糖醛酸上培养的野生型和Δsut-28突变株的相对生物量。（B）野生型和Δsut-28突变株在果胶诱导后对鼠李糖的吸收。（C）野生型、Δsut-28和Δpdr-1突变株在鼠李糖诱导后L-鼠李糖脱水酶与肌动蛋白的相对表达量。(D）野生型和Δcre-1突变株在果胶+葡萄糖诱导下对鼠李糖的摄取。

图5 CRE-1介导的碳源代谢抑制通过糖转运体、转录因子、糖分解和PCWDE基因发挥作用，调节植物细胞壁降解。CRE-1通过抑制糖转运体、转录因子和参与植物生物质成分利用的基因的表达来调控PCWDE调节子的表达。运输到细胞中的糖可能在激活纤维素分解、半纤维素分解和果胶分解基因表达所需的转录因子方面发挥直接或间接的作用。黑色的基因的启动子直接被CRE-1结合，灰色的基因的启动子没有被CRE-1结合。蓝色、橙色和绿色的箭头表示发生在CRE-1介导的抑制下游的调节。

04

DAP-Seq揭示了VIB-1的调节碳代谢中的作用

VIB-1是一种 Zn₂Cys₆转录因子，Δvib-1突变株在微晶纤维素上的生长受到抑制且clr-2表达量下降。使用DAP-seq，总共鉴定了VIB-1的238个直接目标基因。这些直接靶点的基因表达数据的层次聚类显示，其中一个聚类包括了∆vib-1突变体在纤维素和木聚糖上培养时表达下调的大部分基因。作者认为这些基因是VIB-1的核心调节区。VIB-1的共有结合基序在核心调节子基因上游1.5kb的启动子区域内达到峰值，并显示了三个关键的保守碱基：T、A和C。clr-2和pdr-2是VIB-1直接靶标的基因中唯一编码转录因子的基因。Δvib-1突变株在对应的碳源上培养时，clr-2的表达相对于野生型下降了5.2倍，pdr-2的表达下降了3.4倍。除了clr-2和pdr-2之外，还有许多其他PCWDE编码基因被VIB-1调节，包括纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、果胶酯酶、木聚糖酶等。

图6 VIB-1调节子图谱。（A）野生型与∆vib-1突变株在对应碳源条件下的差异表达的聚类。（B）使用MEME v4.12.0，根据VIB-1核心调节区的DAP结合峰序列建立VIB-1结合图案。（C）VIB-1和转录因子CLR-1和PDR-2对分解代谢CAZymes的正向调节，这些因子被VIB-1结合并直接调节。线条的粗细对应于WT和转录因子突变体之间的变化程度，线条越粗表示变化越大。

结论

在自然界中，N. crassa的主要营养来源是植物生物质。在这项研究中，作者确定了N. crassa暴露于不同类型的碳源（包括单糖、二糖、寡糖和植物生物质）时的表达模式。结果表明，N. crassa对植物生物质的成分的反应基本上是特异的，同时也存在对未受对应底物诱导的相关基因的交叉调控。植物细胞壁的成分，特别是纤维二糖和木糖，对PCWDEs的诱导也已在其他担子菌和子囊菌的真菌中得到证实。这些数据表明，丝状真菌对单一的营养（碳源）存在有特别的反应，同时对其他未出现的营养存在有预期并分泌相关降解酶。这种预期可能是由于植物细胞壁的个别成分不可能在自然界中单独存在，因而当真菌感知到一种成分存在时，会同时调控一系列的PCDEs编码基因表达以高效降解植物生物质获取营养。因此，分解植物生物质的真菌的表达图谱是由植物细胞壁的结构和组成决定的。

论文信息

原名：The regulatory and transcriptional landscape associated with carbon utilization in a filamentous fungus

译名：丝状真菌中与碳利用相关的转录和调控图谱

期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

DOI：10.1073/pnas.1915611117

发表时间：2020.01

通讯作者：J. Philipp Benz, N. Louise Glass

通讯作者单位：慕尼黑工业大学，加州大学伯克利分校