作者：刘宸，南京农业大学博士在读，主要研究基于原生生物的土壤青枯菌生物障碍消减。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍原生动物对塑造牛瘤胃中原核生物群体的结构和功能，原文于2021年发表在《The ISME Journal》上。
原生动物这类真核微生物广泛存在于各类环境中，通过和原核微生物群体（细菌和古菌）形成互利共生或捕食关系，进而塑造环境中原核微生物群体的结构和功能。牛的瘤胃是众多与宿主有关的环境中，最为复杂的一类环境，其内真核微生物生物量的半数以上是由纤毛虫这一原生动物群体所构成。但是原生动物群体对于瘤胃中微生物群体的影响以及更深入的对于瘤胃中微生物最终的代谢产出的影响，迄今仍缺乏系统性的评估。为了对这些内容进行评价，本研究构建了体外模型，将获取得到的牛瘤胃原核微生物群体暴露于不同的原生动物（亚）群体中，用以探究不同类型的原生动物对于原核微生物群体的影响。研究发现，不同的原生动物类群对原核微生物群体的结构以及功能产生了迥异和都较强的影响。而且，原生动物这一群体在生态系统中的存在，其本身便增加了原核生物的多样性，同时，研究也发现不同的细菌类型例如 γ‐变形菌纲，普雷沃氏菌属以及密螺旋体属，对于原生动物的响应也并不相同。基于研究结果，猜测原生动物对于原核微生物多样性的维持，可能是通过削弱原核微生物之间的竞争排斥效应得以实现。实验设计及原生动物（亚）群影响下原核微生物群体代谢物的改变
因为不同类群的原生动物通常具有差异的尺寸和形态，因此本实验利用不同孔径的过滤系统连续过滤来构建具有差异化物种组成的原生动物群体（图 1a）。所获的含有所有原生动物的群体（all-protozoa），有着和最初的瘤胃液中类似的原生动物物种组成（图1b）；P-100亚群和 P-60亚群中主要由头毛虫属（Ophryoscolex）和多甲属（Polyplastron）这类体型相对较多的原生动物构成，此外P-60亚群中还存在相对丰度较高的等毛虫属（Isotricha）；P-40亚群中则几乎都是由等毛虫属的原生动物构成；P-10亚群以及P<10亚群则主要由厚毛虫属（Dasytricha）以及相对来说更少一些的内毛属（Entodinium）。等毛虫属在几乎所有的样本中都能检测得到，但是在不同群体中的相对丰度并不相同（~93%（P-40）- ~5%（P<10））。分离得到的原生动物群体和和其同源的原核微生物群体进行96h共培养，每24小时检测其内原核微生物群体的物种组成、甲烷和挥发性脂肪酸（VFA）的产生。基于共培养的结果发现，与P-40亚群进行共培养的原核微生物群体具有更高水平的甲烷产生（图 1d; Wilcoxon test p < 0.01）。其产生的甲烷比同P-100共培养（甲烷产出第二高的共培养组）的群体高出了1.5倍。此外，48小时候共培养后，与P-40共培养的原核微生物群体产生的甲烷高出无原生动物共培养群体的3倍。在使用原生动物质量进行数据标准化后，P-40以及P-10群体相较于P-100以及P-60，展现出了对甲烷生产更高的贡献性（ART-C p < 0.01）。总体来说，原核微生物群体在和小尺寸原生动物（P-10以及P<10）共培养下的甲烷产量显著低于（ART-C test p < 0.05）和较大尺寸原生动物（P-40、P<60以及P-100），但是与无原生动物群体相比仍显著较高（ART-C test p < 0.05）。与较大尺寸原生动物（P-40、P<60以及P-100）共培养的原核微生物群体相较无原生动物群体有显著更高的VFAs产量，但是小尺寸原生动物（P-10以及P<10）共培养下和无原生动物群体在VFAs产量上则无显著差异。同样使用原生动物质量进行数据标准化后发现，P-100共培养和P-40共培养体系无显著差异，但是都较之P-60和all-protozoa共培养更低（图 1d）。这些结果都表明不同原生动物类群对于原核微生物的代谢产出具有迥异但显著的影响。图 1：实验设计以及接种不同原生动物群体后原核微生物最终的代谢产出
注：a:从三只奶牛的瘤胃中获取微生物群体，随后将获得的微生物群体中的原生动物群体分离出来作为全原生动物群体，并使用不同尺寸的滤膜（100, 60, 40, 10 μm，滞留在过滤网上和最终得到的过滤液对应图和文中P100,P60,P40,P10和P<10）进行连续过滤，进而获得尺寸不同的原生动物亚群体。将这些不同的原生动物群体和最初获得的原核微生物群体进行共培养；b:最初瘤胃中得到的微生物群体、全原生动物群体以及过滤后的各原生动物亚群体中原生动物属水平分布；c:通过测量各原生动物群体中源自原生动物的蛋白成分表征原生动物的平均物质量。
原生动物亚群对于原核微生物的差异化塑造
为了研究原生动物群体对原核微生物群体结构的影响，研究采用基于16s rRNA的扩增子测序研究96小时内细菌和古菌群体的群落组成。相关结果发现了不同原生动物类群对于原核微生物群体的群落结构具有清晰且较强的塑造作用（图 2a-b，RDA Pseudo-F = 1.47, p = 0.042），这种差异化的塑造作用在共培养24小时候便可观测得到，且在随后的时间点中稳定存在（图 2a）。为了进一步研究不同原生动物群体塑造影响的强弱，比较了不同原生动物和无原生动物培养得到的原核微生物群体间的Bray-Curtis距离，发现这一距离和原生动物尺寸结构密切相关（图 2c）。更具体的来说，较大尺寸的原生动物群体(P-100, P-60, 和P-40)共培养产生了了较之较小群体（P-10以及P<10）与无原生动物共培养更大的Bray-Curtis距离。研究同样评估了不同原生动物对古菌、细菌alpha多样性的影响。在72小时共培养后，可以观测到不同原生动物群体对于原核微生物alpha多样性的影响：P-100, P-60, 和P-40等大尺寸原生动物较之无原生动物，共培养后的原核微生物具有更高的alpha多样性（图 2d）。这些结果表明，原生动物在牛瘤胃中的存在，对原核微生物群体的多样性和群落结构都具有较强的影响。图 2：不同微宇宙实验中原核微生物群体的结构
注：a:使用PCoA可视化96小时共培养后，源自不同奶牛瘤胃原核微生物群落在不同原生动物群体的影响下所产生的组成差异（基于Bray-Curtis距离）；b:汇总所有微宇宙实验后，基于db-RDA和PERMANOVA的分析结果；c:不同共培养实验下原核群落与无原生动物共培养原核群落间Bray-Curtis距离展示，以及基于配对Wilcoxon rank-sum test的统计分析结果；d: 不同共培养实验下原核群落Shannon多样性的展示，图中表格不展示了two-way ANOVA 对于基于对齐秩转换后数据的分析结果。
为了探究原生动物群体对于原核微生物相对丰度的影响，随后的分析选择了13个纲、27个科、33个属的原核微生物进行分析。这些微生物在至少一个重复（也就是奶牛）的实验中平均相对丰度>0.5%，且总共组成了85%到97%的原核微生物群体。结果发现，在具有原生动物的微宇宙体系中，都观测到变形菌门（Proteobacteria）特别是其中的 γ‐变形菌纲相对丰度的增多（图 3a）。 γ‐变形菌相对丰度的提升在较大尺寸的原生动物（P-100, P-60和P-40）影响下更为明显（图 3a）。值得关注的是，甲烷杆菌纲（Methanobacteria）这类产甲烷古菌在P-100 和P-40共培养的原核微生物群体中具有较高的相对丰度（ART-C test, p < 0.001; 图 3a)。为更深入探究原生动物对细菌、古菌物种分布的影响，研究人员继续开展了属水平的分析。分析结果发现，源自γ‐变形菌纲的Succinivibrionaceae, Succinivibrio, Ruminobacter, Acinetobacter或者这一类总体在与原生动物共培养时显著富集（(Fig. 3b），其在P-100, P-60, 和P-40的平均相对丰度在2.4%-38.7%。而这些微生物在无原生动物的体系中，通常具有更低的相对丰度，或者不存在。与之相反的则是，普雷沃氏菌（Prevotella）和链球菌(Streptococcus)。这两属的菌通常在原核微生物群体中具有最高的相对丰度，但是在和P-100, P-60, 以及P-40 亚群共培养时，其相对丰度显著下降(Wilcoxon test, p < 0.05 图 3b)。这些结果表明，原生动物群体对于一些细菌和古菌的富集具有极为重要的作用。图 3：不同微宇宙实验的物种分布谱
注：a:不同共培养实验下原核群落纲水平的物种分布；b:不同属的相对丰度展示。图中灰色点代表了无原生动物共培养下原核微生物中各属的相对丰度，其他颜色的点则表征不同原生动物群体影响下与无原生动物各属的相对丰度存在差异的点。
为了探究原生动物对于细菌、古菌种水平物种分布影响，这里采用了基于ASV的系统发育分析，结果表明ASV水平的物种分布和之前分析的属水平的结果具有高度的一致性(图 4a）。在多头奶牛共享且在原生动物存在下相对丰度发生改变的ASV中主要是相对丰度提升的ASV类群(图 4a-b；Fisher exact test, ASVs increasing in all cows vs. ASVs decreasing in
all cows ASV; p < 0.001）。在所鉴定的20种相对丰度显著下降的ASV中，仅有6种在至少两头奶牛中出现一致的下降。与之相反的则是，原生动物存在下相对丰度上升的ASV中有39个ASV在至少两头奶牛中观测到相对丰度的上升，更是有17个ASV在三头奶牛中都观测到了相对丰度的上升。相对丰度发生改变的ASV中，最大比例的是普雷沃氏菌和密螺旋体属（Treponema），这两类群体在原核微生物群体中本身具有极高的相对丰度，亦或者仅在原生动物存在可观测到（图 4a-b）。值得注意的是，尽管在原生动物存在的条件下，普雷沃氏菌的相对丰度显著下降，但是其内部多样性则显著上升（图 4c-e）。普雷沃氏菌属内多样性的提升主要体现在丰富度和均匀度的升高，与之相伴的，则是在无原生动物条件下这一属中占据主导的类群，在原生动物的影响相对丰度的显著下降。密螺旋体属这一群体伴随时间的推演，无论是否存在原生动物，其相对丰度都会发生提高，但是在无原生动物影响下，仅有少部分ASV发生相对丰度的变化，但是当存在原生动物时，相对丰度提高的ASV数量显著更多（ART-C test, p < 0.05; 图 4a, b）。上述结果表明，原生动物直接导致了属水平内多样性的提高，同时也表明原生动物的存在保证了系统发育关系更近的物种的共存。图 4：不同微宇宙实验中的ASV分布
注：a:由在至少一个共培养实验中相对丰度>0.5%的原核生物ASV构成的系统发育树；其中阴影颜色表明ASV所在的门；紧邻ASV节点的具有颜色的箱型图标表明这一ASV在有或者无原生动物存在的条件下，相对丰度的差异（红色表示有>无,淡蓝色则相反；紧邻的黑色方形框则表示观测到上述差异的奶牛；堆积柱状图则表示这些ASV在不同实验中的相对丰度；b:存在差异的ASV的分布情况；c-e:普雷沃氏菌属(Prevotella)的c（Shannon指数），d（ASV数量）和e（Evenness）。
本研究从牛瘤胃中获取了混合有原核和真核微生物群体的混合微生物，并通过分离构建了去除原生动物的原核微生物群体以及各类不同的原生动物类群。研究发现，在去除混合微生物群体中的原生动物后，原核微生物群体的多样性发生下降。这些结果表明，原生动物这一群体对于维持牛瘤胃中原核微生物的多样性具有极为重要的作用，同时也保证了系统发育关系较近的原核微生物类群之间的共存。论文信息
原名：Protozoa populations are
ecosystem engineers that shape prokaryotic community structure and function of the
rumen microbial ecosystem
译名：体内生态系统工程师-原生动物塑造牛瘤胃中原核生物群体的结构和功能
期刊：The
ISME Journal
DOI：10.1038/s41396-021-01170-y
发表时间：2021.09
通讯作者：Elie
Jami
通讯作者单位：以色列农业研究中心（Volcani Center）
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