作者：曹文慧，南京农业大学硕士在读，主要研究根际资源调控根际微生物互作
营养缺陷型微生物无法合成其新陈代谢所必需的所有代谢物，需要依靠外源提供。已有大量研究对实验室产生和进化突变的营养缺陷型菌株进行了研究，但对营养缺陷型菌株的适应性机制尚未系统研究。作者从拟南芥叶片中分离了营养缺陷菌株，结果发现有多达一半的菌株是生物素、烟酸、泛酸和/或硫胺素的营养缺陷型。随后作者探讨了微生物的基因型和营养缺陷型的相关性，发现了营养缺陷型菌株比原营养型菌株能保持更高的辅酶储存，在共培养实验中检验了维生素的获取以及营养缺陷型菌株的适应性，最后利用扩展的消费者-资源模型预测了营养缺陷型菌株可以利用其他生物提供的碳水化合物，表明营养缺陷型菌株能从维生素以外的代谢副产物中获益。
为确定本研究的营养缺陷型菌株，作者筛选了一个具有代表性的224个拟南芥叶际菌株集合（At-LSPHERE），在96孔板中培养菌株，培养基分别做如下处理：添加维生素或氨基酸、两种营养物质都添加以及不添加营养物质。156株菌株在培养基中生长的，有50%（78株）的菌株需要补充营养物质才能生长，因此可能属于营养缺陷型。从这78个菌株中，选择50个进一步检测特性，发现大多数维生素营养缺陷型是针对生物素、硫胺素、烟酸和泛酸的，发现每种维生素都存在10个以上的营养缺陷型菌株（图1 a）。由于受到酶标仪数据检测的限制，作者依据菌株生长个数（CFU）确定了22种菌株为营养缺陷型（图1 c）。
为了评估所选营养缺陷型菌株中细胞内维生素储存的潜力，作者用半连续分批培养装置检测了每株菌株在维生素缺乏后偏离指数生长之前的倍增总数，并通过与补充的对照培养物进行比较确定（图1 b）。结果发现大多数菌株的维生素储存量在1-2倍，类似于大肠杆菌突变体。还观察到一些营养缺陷型菌株在去除生物素后的很长一段时间内保持指数增长，可达到4-5倍。金黄杆菌 Leaf201菌株可以在去除维生素后仍然增加9倍（图1 d）。
在了解了22个验证菌株对维生素的需求后，作者以13种原营养型菌株作为对照，依据COG（Orthologous Groups of Proteins）注释，研究营养缺陷型型菌株中的维生素生物合成途径。结果发现所有菌株，包括原营养型菌株，在所研究的四种辅酶（生物素、硫胺素、辅酶A、NAD）的合成途径中缺少许多生物合成步骤（图2）。通过卡方检验比较了营养缺陷型和原营养型菌株维生素合成途径的每个COG途径出现的频率，最终确定了1-3个基因作为营养缺陷微生物的标志性缺失基因。
结果表明，营养缺陷型菌株的基因组较原营养型菌株普遍减小（图3），但是减小的幅度远超过对应的生物合成基因的缺失。因此，作者对所有菌株基因组建立了代谢模型，结果发现在营养缺陷型菌株中基因组的减少无法系统地解释相应辅酶减少的现象，表明营养缺陷型菌株的代谢能力可能不会减少，而且它们可能已经分配了代谢通路来使用必需维生素。
图3. 营养缺陷型与原营养型微生物基因组大小
为了寻找与营养缺陷相关的基因，作者分析了基因组中全部功能基因在营养缺陷型和原营养型之间的分布差异（图4）。总体来说，营养缺陷型和原营养型之间的功能差异主要体现在营养缺陷型菌株基因组中功能基因的缺失。结果发现，营养缺陷型菌株在葡萄糖代谢、氨基酸合成和其他辅酶合成方面与原营养型菌株存在显著差异。
图4. 原养性和营养缺陷型菌株的全基因组比较分析
04营养缺陷型的维生素补充来自共培养物
为研究营养缺陷型菌株是否从共培养的原营养型中获取维生素，作者选择了具有系统发育代表性的维生素营养缺陷型（n = 10）和原营养型（n = 10）菌株进行共培养实验（图5 a、b）。通过16S rRNA基因测序检测共培养细菌相对组成。结果发现在加或不加维生素的两种条件下细菌的相对丰度是相似的（图5 c），并且与是否补充维生素无关（图5 d）。在与原营养菌株一起培养时，缺乏外部维生素补充不会阻止营养缺陷型菌株的生长，并且可能存在维生素交叉喂养。
图5. 共培养实验，以确定营养缺陷型菌株是否能够从原营养体中获取维生素
为了评估是否存在菌株间的交叉喂养，作者检测了上述共培养实验中培养基的维生素含量，结果发现在提供维生素的培养基中，烟酸、泛酸和硫胺素在0-9和9-24小时显著下降，证实了这些维生素被微生物群落吸收。但是生物素的含量没有下降，其原因可能是原营养型微生物分泌生物素的速度大于生物素营养缺陷型微生物的吸收速率。作者还观察到共培养菌群对吡哆醛的吸收和核黄素的积累。在没有提供维生素的培养基中，烟酸、泛酸和吡哆醛显著积累，并在9-24 h时下降（图6），这意味着细菌首先将这些维生素分泌到培养基中并被逐渐吸收。
图6. 在有无维生素供给的环境中胞外维生素浓度
05除了维生素供应，营养缺陷型菌株还受益于共培养
通过比较营养缺陷型和原营养型两组的物种丰富度随时间的变化，作者对添加维生素的无机盐培养基中物种相对丰度进行了分析，发现原营养型菌株相对丰度明显少于营养缺陷型（图7 a）。作者通过生长速率（图7b）和底物消耗速率与消费者-资源模型耦合，并通过共培养实验数据进行模型训练。结果发现，拓展模型仅能有效预测原营养型菌株的丰富度，并无法有效预测营养缺陷型物种丰富度的差异（图7c）。在此基础上，作者还通过引入维生素交互喂养，碳源中间产物对模型进行拓展，以及营养缺陷微生物对于碳源中间产物的亲和力，进行了模型拓展。发现在引入以上参数后，模型可以对实验数据有较好的预测效果（图7 f）。综上所述，该分析表明，碳源交叉喂养能力的提高决定了营养缺陷型菌株在共培养中适应性。
图7. 除了维生素供应，营养缺陷型菌株还受益于共培养
在该研究中，作者鉴定了拟南芥叶片微生物群落中所有主要门的营养缺陷型菌株。研究证实，缺陷型菌株在补充维生素的共培养体系中比在单个培养中生长更好。由于营养缺陷型菌株在原营养菌分泌足够的维生素之前无法恢复生长，因此会优先使用与维生素一起分泌的碳源，从而增加自身的竞争优势。消费者-资源模型框架表明，这种代谢促进作用不仅促进了共存，而且对碳类副产物的优先利用也可能是一种避免竞争排斥的可行策略。总之，营养缺陷型是菌株生存的一种方式，专门消耗其他细菌的代谢产物，因此有利于自然界微生物群落中自由生活模式的细菌（free-living bacteria）存活。
论文信息
原名：Metabolic adaptation to vitamin auxotrophy by leaf-associated bacteria
译名：叶片细菌对维生素营养缺陷的代谢适应
期刊：The ISME Journal
DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x
发表时间：2022.9
通讯作者：Julia A. Vorholt
通讯作者单位：Institute of Microbiology, ETH Zurich
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