作者：刘珍珍，南京农业大学硕士在读，主要研究土壤线虫与根际健康。
LorMe周刊每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍恶臭假单胞菌对革兰氏阴性菌的杀伤机制，原文于2022年发表在《NATURE MICROBIOLOGY》
许多细菌利用依赖接触的杀伤机制来消除环境中的竞争对手。本项研究表明，植物根系定植恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）IsoF能够通过IVB型分泌系统（T4BSS）杀死广泛的与土壤和植物相关的革兰氏阴性菌，该系统以接触依赖的方式将毒性效应传递给细菌竞争对手。生物信息学和遗传学分析表明，这种杀伤机制完全由位于罕见基因组岛内的kib基因簇编码，该簇通过水平基因转移获得。恶臭假单胞菌 IsoF不仅利用这种分泌系统作为杀死细菌竞争对手的防御武器，而且作为入侵现有生物膜的进攻武器，使该菌株能够在其自然环境中生存。
当恶臭假单胞菌（P. putida）IsoF（绿色荧光蛋白（Gfp）标记）和恶臭假单胞菌KT2442（mCherry标记）以1：1的比例在最小培养基板上同时接种，24 h后微菌落不可见红色荧光，说明KT2442已被杀死（图1a）。作者测定了两株菌株的菌落形成单位（cfus），发现在2d后，IsoF已经完全消除了KT2442（图1a）。当两株菌株被0.2 μm的孔径过滤器分离时，没有发现不良影响，这表明杀伤依赖于细胞间的接触（扩展数据图1）。为了进一步了解其潜在的分子机制，在添加了碘化丙啶（PI）的平板上进行接触依赖杀伤（CDK）实验，以观察死亡细胞。24 h后，观察到两种接种培养物重叠处被PI染色，而纯培养区没有死亡细胞（图1b）。延时共焦激光扫描显微镜（CLSM）用于证明KT2442细胞在与IsoF:：Gfp直接接触后被杀死（图1c和补充视频1）。实验发现死亡的细胞没有溶解或改变其形态。为了确定IsoF拮抗的目标物种的范围，作者对几种与土壤和植物相关细菌以及一些植物病原体进行了荧光标记，并测试了它们对IsoF杀死的敏感性。所有测试菌株在与IsoF共培养24 h后均被杀死（图1d，e），表明IsoF具有高效、广泛的宿主范围的CDK机制。图1 IsoF对大量革兰氏阴性菌具有接触依赖性的拮抗作用
为了确定IsoF引起接触依赖性杀灭机制，作者构建了该菌株的mini-Tn5转座子插入文库，并测试了约5000个突变体杀灭金黄色假单胞菌::mCherry（P. aureofaciens::mCherry）的能力（图2）。对8个杀死金黄色葡萄球菌::mCherry的插入突变体进行分析，在一个大基因簇（kib）中发现了4个基因，该基因编码T4BSS的几个元素。为了验证突变体筛选的结果，作者构建了已定义的T4BSS突变体： ΔdotHGF，它缺乏分泌通道的主要结构成分，不能杀死金黄色葡萄球菌（P. aureofaciens）或KT2442。同样，将编码假想蛋白质TrbN和DotD的PisoF_02323至PisoF_02325区域失活，也可以阻止IsoF杀死其他细菌。基于网络的工具ICEfinder31将kib簇识别为基因组岛的一部分，并用基因PisoF_02313和intA_3定义了其边界，与IsoF基因组的平均GC含量（62.6%）相比，kib位点的鸟嘌呤胞嘧啶（GC）含量（58.8%）较低。这个岛有66917个基点和编码61个基因，其中17个共享同源性描述T4BSS结构基因，37被定义为假设的蛋白质，和4编码I型限制性修改（RM）系统和整合酶在3'端（图2b，c）。通过BLAST搜索发现，11株假单胞菌中存在kib基因，其中8株被分类为恶臭假单胞菌。虽然kib岛在少数假单胞菌菌株中被发现，但它高度保守，似乎编码了细菌杀灭机器的所有组成部分，这表明它是最近通过水平基因转移获得的。图2 IsoF T4BSS依赖性杀伤机制编码在GI上
依赖接触的杀死机制将有毒的效应分子传递给细菌的竞争对手。为了避免自杀，攻击细菌产生一种同源免疫蛋白来中和毒素。免疫和毒素基因形成所谓的E-I对，通常是共转录的。为了研究在kib区域是否存在E-I对，作者删除了包含所有kib基因的49.5 kb基因组岛（PisoF_02313到PisoF_02360）。由此得到的突变体ΔT4B不再杀死金黄色原疟原菌或KT2442，并与两株菌株形成混合大菌落（图2d）。假设E-I对的缺失会使ΔT4B突变体对野生型菌株敏感，而其存在则会产生抗性。CDK检测结果显示，该突变株被杀死，而它与ΔdotHGF突变株共存（图3a），表明杀死和自我保护所需的基因存在于kib簇中。此外，IsoF不能杀死突变体ΔdotHGF和Δ23-trbN-dotD，这表明赋予免疫的基因并不位于缺失区域内。免疫基因是必不可少的，因为缺乏免疫蛋白的细胞要么被邻近的细菌杀死，要么因自我中毒而死亡。因此，通过转座子测序（Tn-seq）可以识别潜在的E-I对。作者在IsoF中生成了一个饱和转座子插入文库，并将文库置于三种不同的生长状态：（1） 在液体培养基中摇晃生长以防止细胞与细胞接触，（2）单独在琼脂表面上生长，（3）在竞争对手金黄色假单胞菌存在下生长以促进杀灭（图3b）。分析表明，PisoF_02332在所有三种处理中几乎没有转座子插入（图3c）。该基因似乎与PisoF_02333共转录，可能构成了一个E-I对。为了评估这对假定的E-I对在细菌杀灭中的作用，作者删除了IsoF中的这两个基因（PisoF_02332和PisoF_02333）来生成Δ32-33。另外单独删除假定的效应基因，从而产生突变的Δ33。实验结果发现，与亲本菌株或突变体Δ33相比，Δ32-33在ABC最小培养基上生长较慢。尽管存在生长差异，但为了建立公平的竞争局面，在补充了酪蛋白氨基酸的ABC培养基上进行Δ32-33的CDK测定，并将细胞计数归一化为24小时后从Δ32-3的单培养中回收的细胞数。重要的是，Δ33不能与金黄色葡萄球菌（P. aureofaciens）或KT2442竞争，互补部分挽救了杀伤表型，这表明PisoF_02333编码了一种毒性效应蛋白（图3f，g）。双突变体Δ32-33缺乏对金黄色葡萄球菌（P. aureofaciens）和KT2442的杀伤，进一步支持了无法通过互补恢复杀伤这一观点。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究了其在补体菌株中的表达。虽然观察到一条与免疫蛋白相对应的条带，但无法检测到毒素，这表明与毒素相比，免疫蛋白产生过量。因此，假设是补充菌株中免疫蛋白的非生理性过度表达，有效地中和了效应物，所以杀伤没有恢复。在与IsoF野生型的竞争中，突变体Δ33及其补体衍生物存活，表明这两株菌株都对IsoF效应毒素免疫。相比之下，突变体Δ32-33被IsoF杀死，而补体菌株与IsoF共存，这表明PisoF_02332对kib介导的杀伤具有免疫力（图3d）。为了进一步验证这一点，将突变体ΔT4B和Δ32-33在质粒（pBBR::32）上添加PisoF_02332，并将得到的菌株用于对IsoF的杀灭试验。菌株Δ32-33/pBBR::32与IsoF共存，突变体ΔT4B/pBBR::32被杀死（图3e）。SDS-PAGE分析显示，PisoF_02332在ΔT4B突变体背景中不表达，这解释了其对kib介导的杀伤的敏感性，并表明kib基因簇编码PisoF_02332表达所需的功能或影响其稳定性。
图3 kib基因簇内编码一对E-I
05kib系统使IsoF能够入侵一个已建立的生物膜在CDK检测中，IsoF的生长被限制在初始接种区域，可能是因为死亡细胞创造了一个屏障，阻止进一步杀死（图1b）。然而，在CDK板的长时间孵育后，实验观察到IsoF开始入侵目标菌株所占据的空间，并在72h后形成卫星菌落（图4c）。推测被杀死的细胞最终被裂解，不再构成抵御入侵的屏障，这表明接触依赖的杀伤可能是消除多微生物生物膜中竞争对手的有效途径。为了评估kib介导的杀灭在混合物种生物膜中的作用，作者使用IsoF和KT2442，这两种生物膜都是良好的生物膜生产者。为此，作者首先在流式细胞系统中建立了KT2442::Gfp（绿色）生物膜，然后引入了IsoF::mCherry（蓝色）（图4a）。在1d内，附着在细胞表面的IsoF细胞开始增殖并形成大量的微菌落。2d后，IsoF通过入侵并取代KT2442的生物膜，形成了一个成熟的生物膜。接种IsoF24~48h后，KT2442生物膜体积减少了约40%，在竞争2d后达到与KT2442生物量相等（图4b）。在没有竞争的情况下，KT2442生物膜的生物量随时间稳步增加。当预先建立的KT2442生物膜受到kib突变体ΔdotHGF或Δ23-trbN-dotD的攻击时，两个突变体均不能形成微菌落或入侵现有的生物膜（图4a，b）。重要的是，ΔdotHGF和Δ23-trbN-dotD突变体在分离后形成了与IsoF野生型菌株相似的生物膜。假设IsoF在接触时使用其T4BSS杀死KT2442细胞，为IsoF生物膜的扩张创造了空间。为了验证这一点，将IsoF::Cfp（青色）和KT2442::Gfp（黄色）接种了相同数量的细胞，并通过添加PI（红色）作为细胞死亡的指标来监测IsoF微菌落附近的KT2442微菌落的命运。在两株菌株直接接触的位置观察到死亡细胞（图4d，f）。实验结果表明KT2442的生物膜体积减少了约20%（图4g）。之后，观察到IsoF::Gfp在最小培养基琼脂表面的混合单层生物膜中对KT2442的杀伤作用（图4d）。18h后，观察到92%的KT2442细胞（洋红色）位于IsoF::Gfp（绿色）细胞旁边，这表明kib介导的杀伤严格依赖于细胞间的接触（图4e）。当KT2442受到ΔdotHGF或Δ23-trbN-dotD突变体（绿色）的攻击时，观察到很少的死亡细胞，与单培养生物膜对照相似（图4d，e）。这些结果表明，kib系统不仅允许IsoF保护自己抵御竞争对手，而且还可以杀死生活在一个已建立的生物膜群落中的细菌。图4 IsoF野生型入侵并取代了预先建立的KT2442生物膜
体外竞争实验表明，IsoF杀死了茄科雷尔氏菌（R. solanacearum），而ΔT4B突变体则没有杀死（图5a）。为了评估kib杀灭系统是否可以用于生物防治应用，作者测试了IsoF是否能够保护番茄植株免受茄科雷尔氏菌（R. solanacearum）的侵染。考虑到茄科雷尔氏菌（R. solanacearum）是一种土壤传播的病原体，通过自然开口如侧根或伤口进入植物，作者用小切口建立损伤的番茄幼苗（图5b）。在感染后22d，接种茄科雷尔氏菌的对照植株严重枯萎，有褪绿迹象，根茎系统发育受阻。相比之下，接种茄科雷尔氏菌和IsoF混合物的90%的幼苗没有枯萎的迹象（图5d）。然而，当茄科雷尔氏菌与kib突变体ΔT4B混合接种幼苗时，85%的植株出现枯萎和发育不良，表明IsoF通过kib介导的杀灭阻止了茄科雷尔氏菌向植物组织扩散。为了准确地评估枯萎病的发育情况，作者测定了叶绿素含量，并测量了处理组个体的地上部面积和根重，作为植物健康的替代指标。对这些数据进行了主成分分析和层次聚类（图5e）。前两个成分占方差的93.7%，得分散点图清楚地将单一接种IsoF和ΔT4B组与未处理的植株聚在一起，证实了该菌株对番茄植株没有危害。茄科雷尔氏菌和IsoF共接种的植物优先与健康植物聚类，而与ΔT4B共接种的植物与茄科雷尔氏菌感染的植物聚集。这表明IsoF以kib依赖的方式降低了番茄组织中病原菌的感染。为了验证IsoF确实杀死了茄科雷尔氏菌，恢复了附着在根上的细菌，并测定了菌落形成单位。结果显示与IsoF共接种后出现的番茄红细胞数量明显低于ΔT4B突变体接种后（图5c）。为了评估IsoF在更自然条件下的生物防治潜力，使用一个基于土壤的感染模型（图6）。首先，使用未受伤和受伤的幼苗，仅在用不同的cfu量浸湿的非无菌土壤上测试了青枯病菌的活性。108 cfu ml−1的剂量对受伤幼苗的影响最强，其中约66%的植株没有超过2叶期（图6b，c）。当用IsoF和茄科雷尔氏菌的混合物浸泡非无菌土壤时，84%的植物与对照植物一样发育，而在与茄科雷尔氏菌和kib突变体ΔT4B共同接种的植物中，只有53%的植物长出第二对叶子（图6d–f）。当与IsoF或ΔT4B突变体共同接种时，从根际回收的cfu计数没有显示出茄科雷尔氏菌cfu的降低，这表明茄科雷尔氏菌杀灭可能会局部阻止病原体进入点的植物组织入侵（图6g）。总之，这些结果表明，IsoF对茄科雷尔氏菌的生物防治能力取决于kib基因座。图5 IsoF T4BSS在体外保护番茄植株抗青枯病
图6 IsoF保护在非无菌土壤中生长的番茄植株免受茄科雷尔氏菌的感染
各种病原体利用T4BSS将效应分子易位到其真核宿主细胞中，作者研究表明恶臭假单胞菌（P. putida） IsoF使用T4BSS以接触依赖的方式杀死各种土壤和植物相关的革兰氏阴性菌，将T4BSSs靶向的生物范围扩展到原核生物。数据表明，kib位点是一个最近获得的基因组岛的一部分，该基因组岛编码了杀死机制的所有组成部分。kib簇可能为IsoF提供了在环境中生存的竞争优势，因为IsoF被证明是番茄根系的优秀定植者。IsoF杀死了各种环境菌株，最显著的是恶臭假单胞菌（P. putida）KT2442，它被证明使用其K1-T6SS作为抗菌杀灭机制。IsoF不包含K1-T6SS基因簇的同源物，因此预计对KT2442的杀伤敏感。然而，当两个野生型菌株相互竞争时，IsoF消除了KT2442，表明T4bss介导的杀伤可能发生在KT2442利用其T6SS之前(图1a和3g)。恶臭假单胞菌（P. putida） IsoF具有前所未有的能力，能够以kib依赖的方式侵入和替换已建立的生物膜。结果表明，IsoF不仅能拮抗几种经济相关的植物病原体，还能保护番茄植株的生长（图5和6）。这项研究通过接触依赖性杀灭的生物膜入侵添加到细菌生物控制功能列表中。鉴于生物防治应用中的一个主要限制是接种剂无法在环境中自行生长，利用kib进行攻击和防御的IsoF可以用于生态友好农业战略。论文信息
原名：Pseudomonas putida mediates bacterial
killing, biofilm invasion and biocontrol with a type IVB secretion system
译名：恶臭假单胞菌通过IVB型分泌系统介导细菌杀伤、生物膜入侵和生物防治
期刊：NATURE MICROBIOLOGY
DOI：10.1038/s41564-022-01209-6
发表时间：2022.9
通讯作者：Leo Eberl
通讯作者单位：瑞士苏黎世大学
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