作者：郭赛赛，南京农业大学硕士在读。主要研究铁载体介导溶磷菌活化Fe-P的效果与机制。
主要结果
首先作者将大肠杆菌Nisle(EcN)的与沙门氏菌(STm)在富含CP的培养基中的培养（CP,一种可有效螯合锌元素并降低锌的生物有效性的宿主抗菌蛋白），并对二者生长情况进行比较。结果发现EcN和STm在未添加CP的培养基中显示出相似的增长，但在添加CP的培养基中，EcN的增长明显高于STm（图1a）。这说明EcN在体外较STm对CP具有更好耐受性。已知EcN和STm都具有两种锌转运系统：高亲和力锌转运蛋白ZnuABC和渗透酶ZupT。作者为探究EcN和STm之间对CP抗性的差异是否与锌转运蛋白有关，将两株突变株（EcN znuA zupT和STm znuA zupT）在CP存在下培养，发现二者较其各自的原始菌株生长更缓慢，但在突变株MU CP（MU CP；缺乏结合锌的能力）存在下，或添加ZnSO4的情况下没有出现这种现象（图1b）。这些结果表明，ZnuABC和ZupT在EcN和STm中具有相似的功能，都参与了菌株对CP抗菌作用的逃避。此外，在125–150μg/ml CP的存在下，EcN znuA zupT突变体的生物量是STm znuA zupT突变体的1000倍（图1b）。尽管较高浓度的CP（250μg/ml）限制了EcN znuA zupT突变体的生长，但其生物量仍是STm znuA zupT突变体的100倍（图1c）。而ZnSO4的添加有效恢复了EcN和STm znuA zupT突变体的生长，因此作者假设EcN拥有STm中不存在的额外获取锌元素的机制。
图一：在体外条件下yersiniabactin提高大肠杆菌Nisle对于CP介导锌限制的耐性
前人研究发现EcN产生的铁载体yersiniabactin（Ybt）除了获取铁之外，还可以获取其他金属元素，因此作者推测EcN可以通过分泌铁载体Ybt获取锌元素。为此，作者分别构建了两种突变株，分别敲除了ybt簇编码合成酶HMWP2的irp2基因（该突变株无法合成Ybt），和ybtX基因（该基因编码一种内膜渗透酶，在鼠疫杆菌中，该酶对于铁的摄取是可有可无的，但对于锌的摄取是必需的）。在金属元素缺乏的条件（M9培养基）下，缺乏znuA zupT和irp2或ybtX的三重突变株在M9培养基中表现出严重的生长缺陷，其中野生型生物量是三重突变株的1000倍，EcN znuA zupT是三重突变株的10倍以上（图1d）。此后，所有突变体在添加ZnSO4后恢复生长，添加其他元素则没有这种效果（图1e，f）。表明突变体的生长缺陷确实是由于缺锌导致，并且说明ybt基因簇的产物有助于益生菌EcN在锌限制培养基中获得锌。因此，作者假设Ybt基因簇可能编码锌载体的产生。
作者在M9培养基中培养EcN野生型和irp2突变体，收集培养菌体和上清液，然后通过超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）等对其进行探究和分析。结果发现，在野生型上清液样品中观察到许多锌结合小分子。此外，在EcN野生型的上清液中观察到两个峰（图2c），而irp2突变体中则没有这两个峰（图2c）。后基于Mzmine与GNPS分子网络确定这两个峰为Ybt。随后作者通过从培养物中获取提取物获得的保留时间、准确质量和MS/MS光谱与真实的Ybt标准匹配，确认了这些峰是Ybt的两个非对映体（图2e，f）。最终在LC中和pH后注入锌显示出与锌结合的Ybt物质，表明Ybt确实能够结合锌（图2d）。
为评估铁载体Ybt对铁和锌亲和力的不同，作者将等摩尔量的锌和铁添加到Ybt中的醋酸铵缓冲液中，将pH调节至4、7和10。结果显示Ybt在低pH（pH 4）下优先结合铁，但在高pH（pH 10）下对锌表现出更高的偏好（图2g）。接着作者测试了外源Ybt的添加是否能挽救znuA zupT ybtX突变株和znuA zupT irp2突变体的生长。结果发现，用1μM纯化的载脂蛋白apo-Ybt补充M9培养基，可将EcN znuA zupT irp2突变体的生长挽救到与znuA zupT相似的水平，但突变株（znuA zupT ybtX）没有显著变化（图1g）。此外，作者还发现添加铁载体apoenterobactin（无法与锌结合）对znuA zupT irp2突变体或znuA zupT ybtX突变体的生长没有显著影响（图1g）。说明，Ybt可与铁和锌结合，但其亲和力受pH影响，Ybt可促进EcN在锌限制的培养基中锌元素获取并正常生长。
图二：大肠杆菌Nisle产生的yersiniabactin能够与在与锌结合
04 Yersiniabactin增强了大肠杆菌在发炎肠道的定植
进一步，作者探究了Ybt是否有助于EcN在炎症条件下的生长。作者使用葡聚糖硫酸钠（DSS）小鼠结肠炎模型（图3a），用EcN野生型和znuA zupT突变体的1:1混合物或EcN野生类型和EcN三重突变体（znuA zupT irp2或znuA zupT ybtX）口服接种小鼠。EcN野生型在接种后第1天开始表现出对所有突变体，特别是三重突变体，具有显著竞争优势，到第7天显著增加（图3b，d）。在第7天，EcN野生型比znuA zupT突变体平均高出约23倍，比znuA zupT irp2突变体平均高达约13684倍，而znuA zupT ybtX突变体平均高约767倍。这说明，ZnuABC和ZupT是EcN在炎症肠道定植所必需的，Ybt基因的缺失则加剧了体内znuA zupT突变体的生长缺陷。接着作者进行了第二组竞争性实验，其中选用EcN znuA zupT和一种EcN三重突变体（znuA zupT irp2或znuA zupT ybtX）的1:1混合物口服接种DSS处理的小鼠。结果表明EcN znuA zupT与两种三重突变体相比显示出显著的竞争优势，且随着时间的推移，其增加了约26倍（znuA zupT ybtX突变体）和约45倍（znuA zupT irp2突变体）（图3c，d）。在所有DSS治疗的小鼠中，宿主抗菌基因表达水平（Lcn2、S100a8、S100a9）都有所上调（图3e），且都出现了类似水平的结肠炎（图3f，g）。这些结果表明Ybt的产生（通过Irp2）和Ybt的运输（通过YbtX）都有助于EcN在炎症肠道的定植。
图三：大肠杆菌Nisle通过yersiniabactin获得锌的能力增强了其在炎症肠道的定植
05 炎症和CP是yersiniabactin促进大肠杆菌Nisle肠道定植所必需的
由于在没有炎症的情况下，常规小鼠的EcN定殖水平会随着时间的推移而下降，作者作出假设炎症对于Ybt促进大肠杆菌在肠道大量定植是必需的。作者使用EcN znuA zupT突变株和znuA zupT irp2突变株（图4b）或znuA zupT ybtX突变株（图4c）的1:1混合物接种无菌小鼠，结果在整个实验过程中从两种不同的小鼠粪便中回收了相似数量的菌株（图4b，c）。尽管S100a8、S100a9和Lcn2在定植有EcN的DSS处理动物的盲肠中高度表达，但在定植了EcN的无菌小鼠中，这些基因仅轻微上调（<10倍）（图4d），肠病理学也证实了EcN定殖的无菌小鼠没有炎症（图4i）。为进一步探究Ybt是否为有助于EcN抵抗CP带来的锌限制的影响，作者使用了DSS处理的S100a9-/-小鼠（CP缺乏）（图4e），并用EcN znuA zupT突变株和znuAzupT irp2突变株（图4f）或znuA zupT ybtX突变株（图4g）的1:1混合物接种喂养，观察发现即使小鼠出现了肠道炎症，如肠道炎基因Lcn2、Il17a、Tnfa和Ifng出现高水平表达（图4h）和明显的发病状态（图4i），但是在两种不同小鼠中还是回收了较高相似数量的菌株（图4f，g）。因此结果表明，Ybt通过使EcN逃避CP导致的锌限制，在发炎的肠道中赋予EcN定植优势。
图四：Yersiniabactin介导的锌获取在炎症和CP存在的情况下为大肠杆菌Nisle提供了竞争优势。
本研究表明铁载体yersiniabactin在高pH（pH 10）下可直接与锌结合，并相较于铁具有高的亲和力。大肠杆菌Nisle可以在锌限制性的体外条件下以及炎症肠道中使用yersiniabactin获得锌，从而克服CP带来的锌限制。作者的研究提出yersiniabactin和其他铁载体的作用可能比以前想象的更复杂，可能与清除宿主中的锌有关。许多共生和致病性肠杆菌科（包括耶尔森菌属、大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌）都具有产生yersiniabactin的能力，因此，肠道中通过铁载体获取锌的这一重要机制也可能在其他宿主组织中发挥作用。
论文信息
原名：Siderophore-mediated zinc acquisition enhances enterobacterial colonization of the inflamed gut
译名：铁载体介导的锌获取增强肠道细菌在炎症肠道的定植
期刊：《NATURE COMMUNICATIONS》
DOI：10.1038/s41467-021-27297-2
发表时间：2021.11
通讯作者：Manuela Raffatellu
通讯作者单位：University of California, San Diego: La Jolla, California, US
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