作者：任鹏，南京农业大学博士在读，主要研究根际资源与微生物互作
1,3-丁二烯是合成橡胶和工程塑料生产中的重要单体，但微生物不能直接以葡萄糖为碳源进行该物质的生物合成。在该研究中，作者将cis,cis-muconic acid（ccMA）产生途径与阿魏酸脱羧酶（FDC）突变相结合，构建了一株可以利用葡萄糖合成1,3-丁二烯大肠杆菌突变体CFB222，其中ccMA是中间产物，FDC酶负责将该物质脱羧转化为终产物。结果发现，溶解氧（DO）水平和pH是影响1,3-丁二烯产量的重要因素，使用溶解氧转换下的分批发酵模式，该突变体最终产生2.13 ± 0.17 g/ L的终产物。
图1.基于UbiX-UbiD系统的葡萄糖到1,3-丁二烯的生物合成示意图
FDC脱羧酶底物的特异性是由底物结合位点周围的众多氨基酸残基决定的，作者使用MOE软件创建了FDC和ccMA的结合模型，按照对ccMA亲和力改善因子排列分别构建了不同的AnFDC（源自黑曲霉）突变体和ScFDC（源自酿酒酵母）突变体，并对它们的酶活性进行了测定。结果显示，最佳的突变体为ScFDC F397H:I398Q，与野生型相比，其活性提高了17.2倍，且当pH为6.0时酶活最高（图2a和c，该突变体酶活性高于所有AnFDC突变体，故AnFDC数据此处不再展示）。由于该酶需要氧气的激活，但过渡暴露于氧气也会导致其失活，因此作者进一步探究了FDC在有氧和限氧气条件下的活性。数据显示，在限氧条件下，该酶的活性相对稳定（图2d）。
通过上述研究，作者获得了FDC突变体和CFB21两株菌株，分别负责合成对ccMA具有高度亲和力的酶以及葡萄糖到ccMA的转化（CFB21菌株不携带激活该酶的UbiX系统）。随后，作者培养了CFB22（携带UbiX的CFB21），并将不同的ScFDC基因并入CFB21和CFB22，得到6株不同的全功能菌株，其中CFB222为具有ScFDC F397H:I398Q的突变体。分析发现，在以葡萄糖为碳源进行培养时，CFB222菌株可以合成最多的1,3-丁二烯，且ccMA和PA等中间产物的累积量相对较少（图4）。
图4.全功能菌株利用葡萄糖合成1,3-丁二烯的能力评估
A：ccMA和PA的产量（红色：ccMA；绿色：PA）；B：1,3-丁二烯的产量
图5.氧气含量对CFB222菌株各指标的影响
A：葡萄糖和生物量（实线：生物量；虚线：葡萄糖浓度）；B：ccMA和PA产量（实线：ccMA产量；虚线：PA产量）；C：1,3-丁二烯产量（蓝色-绿色-红色分别表示氧气浓度依次增加）
04罐式发酵——实现1,3-丁二烯的批量生产
研究的最后，作者就CFB222全功能菌株的罐式发酵效果进行了探究，以分析其在实现1,3-丁二烯的批量生产上的实用性。与室内实验不同的是，在罐式发酵中，作者采用了阶段性供氧的方法，即在发酵的0-18h给予微生物充足的氧气供应，而在18h之后将氧气维持在较低水平以保证FDC酶的活性维持在较高水平。图6和图7分别展示了溶解氧转换模式和溶解氧转换的分批发酵模式下CFB222菌株的生长特性和物质转化的影响（pH均为6.0）。结果显示，在两种发酵模式下，CFB222菌株均在36h后生物量不再增长，且中间产物ccMA和PA的浓度大幅度下降（溶解氧转换模式下中间产物浓度下降时间相对提前），并向终产物转化，不同的是，相同培养时间下，溶解氧转换的分批发酵模式可以获得更多的终产物。
图6.解氧转换模式下CFB222菌株的罐式发酵
A：葡萄糖和生物量（黄色：生物量；蓝色：葡萄糖）；B：中间产物浓度（红色：ccMA；绿色：PA）；C：终产物浓度
图7.溶解氧转换的分批发酵模式下CFB222菌株的罐式发酵
A：葡萄糖和生物量（黄色：生物量；蓝色：葡萄糖）；B：中间产物浓度（红色：ccMA；绿色：PA）；C：终产物浓度
传统的随机突变手段是获得突变体的一种强有力的手段，但费时费力。在该文章中，作者基于计算机进行了合理的酶设计，构建了一株可以直接利用葡萄糖合成1,3-丁二烯的突变体菌株，并分别针对中间产物和终产物合成阶段氧气需求的不同进行了溶解氧的平衡，以充分优化1,3-丁二烯的生物发酵，最终在罐式发酵条件下葡萄糖被高效地转化为所需的终产物。
论文信息
原名：Direct 1,3-butadiene biosynthesis in Escherichia coli via a tailored ferulic acid decarboxylase mutant
译名：基于阿魏酸脱羧酶突变大肠杆菌实现1,3-丁二烯的直接生物合成
期刊：Nature Communications
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-22504-6
发表时间：2021.8
通讯作者：Tomokazu Shirai
通讯作者单位：斯坦福大学
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