作者：孙天宇，南京农业大学博士在读，主要研究核心链霉菌介导的根际抑病菌群互作与调控机制。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍可持续农业中有潜力抑制番茄青枯菌的细菌成员，并为青枯菌抗性番茄品种的根际细菌遗传力提供见解。原文于2022年发表在《Microbiome》上。
茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum, Rs)是一种植物土传病害，会导致细菌性青枯病并造成如番茄等多种作物的减产。研究表明，青枯菌抗性番茄品种可以从土壤中招募有益微生物，在根际形成有益微生物组来抵御Rs的入侵，但是这种招募方式能否从母本遗传到子代还有待研究。本研究通过对亲缘关系明确但抗性不同的番茄根际微生物群落进行研究，结果表明，添加自然土或自然土浸提液种植的抗病番茄品种病情指数低于无菌种植的抗病番茄，说明土壤微生物组在抵御Rs过程中的重要性。16S rRNA 基因扩增子测序结果表明，抗病番茄的根际微生物群落比易感品种更稳健，此外，抗病子代HF12的根际微生物组与抗病亲本HG64相似。宏基因组学证明，根际微生物组在HF12和HG64之间具有功能的一致性。基于多组学分析与实验验证，在HF12和HG64中富集了两种根际细菌，分别是鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp. Cra20)和假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)，且能够为易感Rs品种的番茄提供很好的保护。该保护涉及多个方面，包括减少Rs的毒力相关基因以及重塑易感番茄的转录组。本研究发现了在可持续农业中有潜力抑制番茄青枯病的细菌，为青枯菌抗性番茄品种的根际细菌遗传力提供见解，与番茄遗传物质的传递相呼应。本研究通过盆栽实验，初步验证了番茄对Rs的抗性，并探讨了土壤微生物在Rs抗性中的重要性。易感品种在自然土和无菌土中均表现出较高的病情指数。在自然土壤中生长的抗病品种表现出较强的抗Rs能力，而在无菌土壤中生长的抗病品种则没有(图1)。所有在自然土壤中生长的品种的病情指数均显著低于在无菌土壤中生长的品种(图1，P < 0.05)。自然土壤浸提液在一定程度上维持了抗病品种的抗性，施用自然土壤浸提液的处理组病情指数显著低于无菌土处理组(图1，P < 0.05)。这些结果证实了番茄品种抗Rs的差异以及土壤微生物组对Rs抗性的重要性。图1 番茄抗病性的验证及土壤微生物组对抗性的重要性
为了探究抗病番茄品种亲本和子代根际微生物群落与易感亲本相比的动力模型和特征，本研究在接种Rs前后的三个采样时间点对细菌群落进行16S rRNA基因扩增子测序。通过Alpha和Beta多样性分析，评价了抗病品种和易感品种之间的总体差异。Rs未接种时，4个品种的Shannon指数均无显著差异(图2A)。接种Rs后，所有品种的Shannon指数都有所下降(图2A)。除HG64在T2时外，抗病品种均保持相对较高的水平(图2A)，说明抗病品种的菌群稳定性较好。PCoA显示，样品不随采样时间而分离，在第一个轴上通过Rs接种分离，在第二个轴上根据抗病性质进行分离(图2B)。置换多元方差分析(PERMANOVA)结果表明，采样时间的影响低于番茄抗病性，在接种Rs的处理中尤为明显（表1）。因此，Rs对于番茄根际微生物群落有较强的干扰作用，且抗病品种和易感品种的根际微生物群落差异明显。此外，与易感品种相比，接种Rs的抗病品种更接近不接种Rs的健康样品(图2B)。这一结果与Shannon指数结果(图2A)共同表明抗病番茄根际的微生物群落比易感番茄根际的微生物群落具有更强的缓冲病原体干扰的能力。图2 抗性番茄品种的稳定性
A: 未接种（T1、T2C和T3C）或接种（T2和T3）Rs的四个品种在不同采样时间点的Shannon指数；B: 基于加权Unifrac距离的PCoA；C: 接种或不接种Rs的抗性和易感品种的分子生态共现网络
表1 不同采样时间点和番茄抗性性质的置换多元方差分析为了研究四个番茄品种根际微生物群落的内在相互作用，本研究基于属水平的相对丰度构建分子生态网络。在没有Rs胁迫的情况下，除了抗病品种比易感品种表现出更多的正向相互作用外，抗病品种与易感品种之间无显著差异(图2C; 表2)。接种Rs后，抗病品种(除HG64外)和易感品种的正向相互作用的百分比均增加(表2)，表明协同相互作用可能在对抗细菌性青枯病中发挥重要作用。易感品种的网络在Rs接种后没有显著变化，而抗病品种的网络则在Rs接种后显示出更复杂、更稳健和更紧密的网络（图2C）。换句话说，节点从1017个增加到1793个，平均度增加了两倍以上，平均聚类系数在一定程度上增加，平均路径距离从4.96个减少到3.79个（表2）。此外，抗病品种的这种模式在抗病亲本HG64和后代HF12之间是一致的，HF12和HG64的相似变化支持了这一点（图2C；表2）。这些结果表明，抗病品种具有高灵敏度和稳健的网络，这些网络是从亲本遗传到后代的。表2 根际微生物群在属水平上的分子生态网络特性
抗病子代HF12的根际微生物组与其抗病亲本HG64相似为了研究抗病亲本HG64与其后代HF12之间的关系，分别分析了每个采样时间点的Beta多样性。在大多数处理中，抗病品种和易感品种之间的距离明显，子代HF12与抗病亲本HG64的距离比与敏感品种的距离更近。因此，抗病后代的根际微生物组与其抗病亲本相似。为了对抗病亲本HG64遗传给子代HF12的根际细菌的分类组成进行分析，研究了HG64遗传给子代HF12的抗病细菌。在土体土和番茄根际土中，数量最多的属有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas), 假节杆菌属 (Pseudoarthrobacter), 芽单胞菌属(Gemmatimonas), 德沃斯氏菌属(Devosia)和芽孢杆菌属(Bacillus)。田间土壤与番茄根际土壤存在一定差异。例如，芽单胞菌在田间土壤中比根际土壤中更丰富。这些差异表明了植物的选择效应。与PCoA和PERMANOVA结果一致，在不同采样时间点，分类组成没有显著变化，可能是由于采样间隔相对较短(5天)。三个采样的时间点LEfSe (Linear discriminant analysis Effect Size，线性判别分析) 分析表明, 与易感品种相比，许多细菌（如鞘氨醇单胞菌属、黄杆菌属、布氏杆菌属和鞘脂菌属）在HF12和HG64中富集 (图3)。在这些细菌中，鞘氨醇单胞菌属和黄杆菌属在除了T2C (图3) 以外的所有采样点均被富集 (图3)，这表明它们是潜在的可遗传的生防细菌，可以抵抗青枯病病原菌。图3 抗病亲本HG64和子代HF12的差异富集属
A: HG64与敏感品种的LEfSe比较；B: HF12与敏感品种的LEfSe比较；C: 维恩图显示HG64和HF12之间共享的差异富集属
本研究通过宏基因组测序，在更精确的分类水平上研究微生物群落，探究其潜在功能，本研究选择了前两个采样时间点的样本，因为从扩增结果来看，采样时间的影响相对较小。宏基因组学和扩增子产生的分类组成（门级）的相关系数很高（Spearman相关=0.58，P<0.001），表明这两个数据集之间存在相当大的一致性。基于物种水平上的Bray-Curtis距离的PCoA表明，样品在第一个轴上被病原体Rs的接种分离，在第二个轴上被抗性性质分离。在未接种病原菌的T1和T2C采样时间点，抗病品种和易感品种在第二轴上可以明显分离，这与扩增子PCoA结果一致(图2B)。在接种了病原体的T2采样时间点，抗病和易感品种没有明显聚类，这可能是因为接种的Rs所导致。LEfSe分析表明，物种水平上的细菌组成表明，与易感品种相比，抗病品种中大量的鞘氨醇菌和恶臭假单胞菌富集 (图4)。这两个菌株在T1时都在抗病亲本和后代中富集，鞘氨醇菌在T2C时在抗病亲本和后代中都富集，而在T2时在抗病亲本和子代中没有共同富集 (图4)。因此，鞘氨醇菌和恶臭假单胞菌是潜在的可遗传生物防治物种。图4 抗病亲本和子代中差异富集的种
A: HG64与易感品种的LEfSe比较；B: HF12与易感品种的LEfSe比较；C: 显示HG64和HF12之间共享差异富集物种的Venn图
基于KEGG三级功能分类的PCA图显示，在第一个轴上接种Rs对样品进行了分离，而不是通过番茄抗性和采样时间点进行分离。统计差异功能热图显示，接种Rs后，外源性物质生物降解与代谢、其他次生代谢产物生物合成和细胞运动性等功能增加。接种Rs后，辅酶因子和维生素、萜类和聚酮类化合物、能量和氨基酸的代谢等功能降低。为了进一步探索在抗性亲本和后代中富集的功能，使用DESeq2进行差异富集分析。本研究只分析了未接种Rs的样本，因为Rs的序列可能掩盖了番茄抗性引起的真实变化。与易感品种相比，抗病亲本HG64和后代HF12在T1和T2C时四环素生物合成减少，但在T2C时HG64中变化不显著(图5)。实心圆和空心圆分别表示显著性（Padj<0.05）和非显著性。HF12和HG64中丰富的函数用红色矩形表示。为了获得在抗病品种中富集的潜在可遗传的生防菌，并验证其对Rs的潜在生防效果，采用不同的培养基和条件从抗性后代HF12中培养出细菌。共分离到259株细菌，隶属于7纲15目58属(图6A)，可见分离菌株的多样性。其中，微球菌属、杆菌属、根瘤菌属和链霉菌属相对丰度较高，分别为27.03%、25.48%、12.74%和8.11%。在扩增结果中检测到的含量最高的5%属中，已经分离出19.6%(18/92) (图6B)。在这些细菌中，芽胞杆菌科、链霉菌科、德沃斯氏菌科和鞘氨醇单胞菌科以高丰度分离（图6B）。大约69%（40/58）不属于扩增子前5%丰度的属，如金杆菌属、节杆菌属和红球菌属。本研究成功地分离到鞘氨醇单胞菌属Cra20和鞘氨醇假单胞菌属BF-R33菌株，它们是潜在的可遗传生物控制细菌属。然而，没有获得属于恶臭假单胞菌的菌株。恶臭假单胞菌KT2440由陈文丽教授提供作为替代品。总之，本研究中培养的细菌为我们的后续验证实验提供了材料，并从番茄根际建立了抗青枯病的细菌资源。图6 抗病番茄品种的根际细菌
A: 使用259种可培养细菌16S rRNA的基因序列构建系统发育树；B: 可培养细菌与扩增子结果的比较
基于扩增子、宏基因组学和培养组学的结果，本研究认为鞘氨醇单胞菌Cra20、鞘氨醇假单胞菌BF-R33和假单胞菌KT2440是潜在的可遗传生物控制细菌。进行了平板对峙和盆栽实验，以进一步验证其在抵抗病原体Rs中的作用，并揭示其富集与番茄抗Rs之间的因果关系。基于平板对峙实验，未观察到对Rs的直接抑制作用。盆栽试验表明，Cra20和KT2440在无菌苗圃土壤中对常用的易感品种Moneymaker提供了相当大的抗Rs保护，而BF-R33仅提供了很少的保护（图7A）。接下来，测试了Cra20和KT2440对易感亲本HG70的生物防治能力，它们都在无菌土壤中表现出明显的保护作用，其中Cra20的表现优于KT2440（图7B）。通过在自然土壤中进行类似于Moneymaker和HG70的盆栽试验，在自然条件下测定了这些样品的生物防治潜力。考虑到KT2440不能在田间土壤中对Moneymaker提供抗Rs保护，因此跳过了该实验，仅测试了其对HG70的生物防治潜力。结果表明，Cra20不能保护Moneymaker免受Rs攻击（图7C）。Cra20和KT2440都显示出对HG70上的Rs的保护，但Cra20的效果不如无菌土壤中的效果（图7B，D）。考虑到这两种菌株具有良好的生物防治效果，需要确定它们在降低无菌土中生长的抗性品种HF12和HG64的病情指数方面的潜力。盆栽实验表明，它们并没有显著降低病情指数。这一结果，以及土壤提取物接种和自然土壤盆栽试验的结果（图1），表明其他微生物或土壤微环境对Rs抗性至关重要。总之，Cra20和KT2440是可以抵抗Rs的可遗传细菌。图7 潜在可遗传生防菌对Rs GMI1000的生物防治试验
A: 无菌苗圃土壤中生长的Moneymaker的生物防治效果；B: 在无菌苗圃土壤中生长的易感亲本HG70的生物防治效果；C: 对自然土壤中生长的Moneymaker的生物防治效果；D: 在天然土壤中生长的易感亲本HG70的生物防治效果
形态观察和扫描电镜显示，Cra20在R2A平板上为浅黄色短棒状细菌。基于Cra20全基因组的分类分析表明，其最接近的物种是鞘氨醇单胞菌（Sphinomonas sp.Cra20 NZ CP024923）（平均核苷酸同一性，ANI 85.59%）。本研究中分离的Cra20是一个潜在的新物种。预测Cra20不含CRISPR，这表明可以使用其他方法（例如限制性修饰系统）来防止外源DNA的入侵。它包含4139个基因，其中1787个成功地用KEGG功能注释。主要参与遗传信息处理、细胞运动、信号转导、复制和修复、耐药性以及维持基本代谢过程并与外界相互作用的碳水化合物和氨基酸代谢。因此，它可以适应并定殖于植物的根。BGC的分析表明，它只包含四个BGC，其中一个编码萜烯，其最相似的已知簇是数据库中的玉米黄质（相似度100%），可能解释了它的浅黄色菌落。其他三个BGC没有最相似的已知集群。没有发现具有已知拮抗作用的BGC，如非核糖体肽和细菌素，因此支持对Rs缺乏拮抗作用。由于平板对峙实验中Cra20和KT2440均未直接拮抗Rs，本研究从其他方面研究了Cra20和KT2440提供的抗病性下的潜在机制。用这两种生防菌的培养代谢产物处理Rs。结果表明，Cra20显著抑制了Rs的EPSs相关基因（即EpsA、EpsE和EpsF）和T3SS相关基因（例如PhcA、hrpB和hpaP）的表达（图8A，P<0.05），KT2440显著抑制了Rs的EPSs相关基因（即EpsA、EpsE和EpsF）、T3SS相关基因（例如AWR、hrpB、hrcC和hpaP）和质子逆向转运蛋白基因（即cel）的表达（图8A，P<0.05）。接下来，研究了由这两种生防细菌触发的番茄根转录组的反应，以从宿主角度寻找抗病线索。PCA结果表明，用Cra20和KT2440处理的样品与CK样品分离，用Cra 20和KT244处理的样品彼此略有分离（图8B）。然后，对由Cra20或KT2440触发的DEG进行k均值聚类（图8C）。Cra20和KT2440诱导（cl4）和抑制（cl6）的两个基因簇，另外四个簇被不同的上调或下调（图8C）。KEGG富集分析表明，由Cra20和KT2440诱导的簇主要富集了与植物激素信号转导相关的功能（cl4，主要包括生长素响应蛋白）。它们共同抑制的簇中（cl6），与植物-病原体相互作用、苯丙氨酸代谢、MAPK信号通路以及精氨酸和脯氨酸代谢相关的功能均得到了富集（图8C，D）。由Cra20特别诱导的簇主要富含参与光合作用的功能（cl2），而KT2440特别诱导的簇主要富含与苯丙类生物合成相关的功能（cl1，主要涉及过氧化物酶相关蛋白）（图8C，D）。总体来看，Cra20和KT2440分别抑制了苯丙类生物合成（cl3，主要涉及过氧化物酶相关蛋白）和硫代谢（cl5）（图8C，D）。综上所述，这两种生防细菌与番茄相互作用，并以相似和特异的特点重塑番茄转录组。图8 Cra20和KT2440对Rs GMI1000毒力基因表达的影响
A: EPSs相关基因：EpsA、EpsE和EpsF。药物质子反转运蛋白基因：cel。运动相关基因：pilQ、fliT和motA。T3SS相关基因：AWR、PhcA、hrpB、hrcC、hrcV、hrpG、hapB和hpaP; B: PCA图基于FPKM排序的前500个基因；C: DEG的热图；D: KEGG功能富集的气泡图
本研究通过多组学分析和实验验证，揭示了土壤微生物群落在抵御Rs入侵过程中的重要性。结果表明，抗病番茄品种根际微生物群落具有较强的鲁棒性，并发现了两个可遗传的根际细菌，可为易感番茄提供较好的抗Rs保护。此外，研究还揭示了多个方面的保护作用，包括干扰Rs的毒力相关基因和重塑易感番茄的转录组。本研究为番茄根际细菌的遗传力提供了见解，可以增强对Rs的抗性，与番茄遗传物质的传递相呼应。论文信息
原名：Heritability of tomato rhizobacteria resistant to Ralstonia solanacearum
译名：番茄根际细菌对青枯菌抗性的遗传力
期刊：Microbiome
DOI：10.1186/s40168-022-01413-w
发表时间：2022.12.15
通讯作者：Lifang Ruan
通讯作者单位：华中农业大学生命科学与技术学院，农业微生物学国家重点实验室；西藏农牧大学资源与环境学院
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