作者：田秘密,南京农业大学博士在读,主要研究植物激素代谢调控根际免疫。
PGPR有多种不同的机制来促进植物生长和健康：间接机制，如启动宿主免疫以诱导系统抗性或微生物组转移、抑制病原体；直接作用，增加营养供应或调节植物激素，如乙烯水平等。ACC作为一种化学引诱剂参与PGPR根际组装。基因acdS，编码ACC脱氨酶或1-氨基环丙烷-1-羧酸，是对植物促生和抗性提升最为重要的基因之一，能降低根际应激诱导的乙烯水平，有效促进逆境下的植物生长。目前，尚不清楚ACC的叶际作用机制。作者发现定殖在番茄根际的伯克霍尔德菌株Msb3通过ACC脱氨酶作用促生。结果表明，ACC降解不仅是PGPR的一个重要特性，也是叶际细菌的特性，以喷雾接能促进叶际有益菌定殖。因此，叶际投入ACC脱氨酶细菌应用可作为提高植物抗性、病害控制和获得高产的一种可行策略。
Msb3易于在番茄叶际定殖并促其生长
为评估菌株的促生特性，在是否施肥的情况下，以活的或热杀Msb3（3 × 106 CFU ml−1）接种于植物并于60天后测植物生长量（图1）。结果证明，接种Msb3的植物不论施肥与否都比对照生长更好（图1a）。同时，通过单拷贝标记基因gyrB的qPCR来估算60龄植物顶端分生组织最幼嫩的叶片上的细菌丰度。结果发现，叶片上定殖大量Msb3，每ng DNA 430个Msb3-gyrB拷贝（图1b）。而对照植物上未检测到Msb3定殖。接着，对番茄体外生长的不同环境进行了实验，以相同的方法对菌株丰度进行定量，获得相似结果，且Msb3丰度与可在叶际高定殖菌株PsJN丰度一致。
图1 番茄接种热杀或活的Msb3生长60天的情况
Msb3在叶际活跃分裂
为解释叶片检测到的拷贝数，假设Msb3能够在番茄叶片上或内部主动分裂，以促进大量定殖。作者用高度稀释的细菌悬浮液（OD600为0.001）接种幼苗，探针Burkho进行荧光原位杂交（FISH）后在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）上进行显微镜分析。结果证实假设（图2），在所有接种植物的叶片下表皮均检测到Msb3，对照中仍未检测到。24小时后，只有少数单个细胞附着在叶片下侧（图2a、d）。48小时后出现细胞簇（图2b、e），72小时后这些簇进一步成熟（图2c、f）。这些结果说明，Msb3在叶际活跃分裂。
图2 叶片接种Msb3群体动态的显微镜分析
Msb3在叶际中最为丰富
为探索菌株Msb3是否于叶际丰富定殖，以Msb3、PsJN或不接菌处理幼苗，为期四周时间，每周采集一组样本，量化地上部或根系DNA提取物中gyrB基因，比较Msb3和PsJN在叶际和根际的生长情况。结果发现，叶际Msb3丰度都明显高于根际（图3）。两菌株的叶际丰度在第二周、三周逐渐下降，而植物枝条以最大速度伸展。21DPI叶片上的细菌丰度稳定并再次增加。28DPI Msb3叶际含量显著高于PsJN。尽管根的伸展与地上部表现相似幅度，但根际细菌相对丰度始终保持稳定（图3）。
为阐明菌株Msb3的生态学并了解它在植物上的定殖位点，通过FISH分析了这些时间点的样本。结果发现，Msb3常定殖于叶片气孔，却很少在气孔深处、内球体，偶尔在毛状体内部（图4a、b、c）。Msb3经常在下表皮大簇中检测到（图2b、e、c、f和4e）。在根毛顶端的短暂定殖，但未在主根定殖（图4f）。仅根部受伤时，细菌才会聚集在根部裂缝（图4d）。
图3 qPCR定量分析不同组织上Msb3和PsJN群体动力学
Msb3主导乙烯生物合成来实现植物促生作用
在研究Msb3促进番茄宿主生长的分子策略时，其基因组显示Msb3携带几个与促生相关基因。假设固氮作用在兼性共生互作中作为营养物质的进一步来源以及通过ACC脱氨酶基因acdS调节植物激素的作用，这些途径在叶际定殖菌株中所起的作用在很大程度上是未知的。为此，通过敲除acdS或nifH（固氮标记基因）构建了Msb3突变系。nifH菌株对植物定殖和促生特性未发生变化，说明氮供应对菌株Msb3的植物促生现象可能没有贡献。然而，acdS敲除减弱Msb3对植物促生作用。Msb3ΔacdS接种的植物不再产生与Msb3野生型（wt）接种植物同等侧根数（图5a）。添加ACC后仅影响侧根长度而非侧根数量，这表明番茄侧根形成不是根际ACC水解来诱发的（图5b、c）。Msb3依赖性生长促进导致侧根形成，而侧根形成不受根中乙烯信号的影响。此外，在植物表型中，与未接种对照相比，接种Msb3幼苗株高显著增加（图5e、 f）。Msb3ΔacdS处理的植物中被完全抑制，表明这种促生作用是依赖ACC脱氨酶的（图5e）。
为建立Msb3-ACC脱氨酶活性与植物乙烯水平调控之间的因果关系，利用广谱突变系于拟南芥进一步以ACC作为RGI诱导剂进行了根系生长抑制（RGI）测定。ACC严重影响Col-0的主根长，但Msb3接种会抑制RGI。Msb3ΔacdS处理未显著减弱ACC诱导的RGI（图5f、g）。缺乏乙烯感知和信号转导的中枢调节因子的乙烯不敏感系ein2-1不受ACC诱导的RGI影响。在ACC下，Msb3或Msb3ΔacdS处理的ein2-1突变体植物的主根长度之间没有差异（图5f）。这些结果清楚地表明乙烯是RGI的激发子，ACC水解是其抑制的原因。
图4 Msb3菌株在番茄上的定殖模式
acdS缺乏不会影响叶片定殖能力
由于ACC作为PGPR的化学引诱剂发挥作用，假设acdS敲除可能影响Msb3定殖叶片的能力，从而影响其PGP效应。为确保Msb3ΔacdS不仅表现出受损的植物定殖表型，进行了再培养测定以量化CFU作为活性细胞的代表。结果未发现Msb3ΔacdS在番茄地上部定殖和存活能力减弱（图5d），这表明ACC脱氨酶缺乏是Msb3△acdS PGP抑制的原因，而不是其地上部的定殖能力。
图5 Msb3菌株在番茄上的定殖模式
在土著群落条件下，叶面喷雾可促进acdS依赖性生长
为说明在非无菌条件下应用产ACC脱氨酶菌株的叶际定殖潜力，对生长在非无菌土壤中的非共生番茄进行了生长测定。将7龄幼苗浸入细菌悬液或对照溶液中，并转移到单独的花盆中。7天后，下胚轴长度和幼苗重量量化结果与体外实验一致（图6a、b）。接种Msb3比ΔacdS或对照处理的幼苗明显更长（图6a）、更重（图6b）。此外，移植后以地上部喷洒方式接种Msb3或ΔacdS悬浮液。与浸润接种出现相同结果，Msb3幼苗显著优于ΔacdS缺陷株或未接种的幼苗（图6a、b）。
图6 Msb3和Msb3ΔacdS在土著菌群条件下以叶面喷雾接种对番茄的影响
植物整个生命周期中，叶际可及性是成功引入有益微生物的关键。在培养过程中的任何时间点均可进行干预，以重建和维持宿主微生物群的稳态。因此，通过叶片接种，利用ACC水解菌在田间促生和缓解胁迫作用似乎更容易实现。PGPB水解ACC已被证明是在实验室条件下缓解胁迫和促进植物生长的有力工具。为将这些菌株转化为实际应用，我们需要考虑成功实施的策略。植物乙烯库的操纵似乎是通过根系起作用的，更重要的是，为地上部施用提供了充分的证据。本文提出利用叶际在植株发育中的先锋效应，可能有助于实现叶际微生物辅助作物生产的潜力。
论文信息
原名：Phyllosphere symbiont promotes plant growth through ACC deaminase production
译名：叶际共生体通过产生ACC脱氨酶以促进植物生长
期刊：The ISME Journal
DOI：10.1038/s41396-023-01428-7
发表时间：2023.06.01
通讯作者：Wolfram Weckwerth
通讯作者单位：维也纳大学
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