作者：薛娇，南京农业大学硕士在读，主要研究铁载体与植物互作。
铁素竞争是根际微生物生态位建立的重要因素。致病性和有益细菌利用各种分泌系统与其宿主相互作用，并从环境中获取有限的资源。芽孢杆菌属是具有VII型分泌系统（T7SS）的重要植物共生体，但这种分泌系统在根际细菌-植物互作中的作用尚不清楚。因此，本研究以贝莱斯芽孢杆菌SQR9为研究材料，研究并发现其VII型分泌系统（T7SS）分泌的YukE蛋白能在菌-植互作早期插入根细胞膜，导致根细胞的短暂性铁泄漏，为芽孢杆菌在植物根表快速定殖提供所需的铁元素，从而促进了SQR9的定殖。本文揭示了T7SS在植物-微生物互作中的相互作用，为菌-植互作中铁素获取机制提供了一种新的见解。
1、T7SS有助于芽孢杆菌在根系的定殖
作者首先对芽孢杆菌SQR9的基因组分析，发现yuk和yue基因簇组成T7SS的编码区域（图1a），SQR9样本的RNA-seq结果显示yueD、yueC、yueB、yukAB和yukC的转录活性之间存在很强的相关性(图1b)。为研究T7SS对根-细菌互作的影响，在SQR9中分别删除T7SS分泌蛋白基因yukE、VII分泌组成基因（yukD-yueD）和T7SS编码区域(yukD-yueD和yukE)的基因，得到突变体DyukE、DT7和DT7E，以及相应的互补菌株DyukE-C、DT7-C和DT7E-C。通过对YukE进行荧光标记并制作YukE-GFP的标准曲线，测定出野生型SQR9分泌到培养基中的YukE-GFP的浓度计算为5μM（图1d）。研究发现水培条件下，在植株接种菌株两天后，DyukE、DT7和DT7E在拟南芥根系定殖数量显著降低，而互补菌株可恢复它们的定殖能力(图1e,f)，无论是无菌土壤还是在其他微生物存在的情况下，T7SS和分泌蛋白均有助于SQR9的根系定殖。
2、芽孢杆菌通过T7SS降低根部铁含量
为探究T7SS和YukE对芽孢杆菌在根系定殖的影响机制。作者通过Perls染色分析和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量植物铁含量。染色结果表明野生型SQR9和纯化的YukE蛋白在接种后24h显著降低铁染色(图2a-c)，突变体DT7、DyukE和DT7E则不会降低铁染色，而野生型SQR9和纯化的YukE可恢复DT7、DyukE和DT7E根铁减少的现象。这些结果表明SQR9可能依赖T7SS和YukE来降低根铁含量。与此同时，ICP-MS测量的拟南芥根铁含量与Perls染色的结果一致，野生型SQR9和纯化的YukE均可降低根铁含量（图2d,e）。随后作者发现，在接种48小时和72小时后，野生型和突变体都没有影响植物根部铁含量（图2f）,这表明SQR9和Yuke降低根部铁含量只发生在定殖早期。
为测试SQR9和YukE的这些根铁减效应在不同条件下是否一致，作者在自然土壤、无菌土壤、和加入自然土壤中微生物群落的无菌土壤中种植拟南芥，同时在自然土壤和水培条件下种植黄瓜。结果发现，野生型SQR9和纯化的YukE在土壤生长条件中均降低了拟南芥和黄瓜根部的铁含量。随后验证YukE的传感抑制剂K252a和胞吐抑制剂brefeldinA(BFA)均不会影响Yuke引起的铁降低的现象，这也表明YukE可直接降低根部铁含量，并且YukE的铁减效应只在根成熟区观察到（图2h,i）。
图2 SQR9衍生菌株和YukE对植物铁含量的影响
3、过量的铁拯救了T7SS突变体的定殖缺陷
作者进一步假设SQR9可使用T7SS分泌的YukE竞争铁素达到促进其定殖的作用。为此，作者在高铁浓度(180μMFe)和标准铁浓度(90μMFe)的Murashige和Skoog(MS)培养基进行根定殖试验。结果显示在高铁浓度下，DT7、DyukE和DT7E突变体较野生型在根系定殖方面没有差异，而在标准铁浓度下，三株突变体在根部定殖显著降低（图3a），这也表明了过量的铁可挽救突变体的根定殖缺陷。同时，野生型SQR9在含有300μM的铁载体ferrozine的缺铁MS培养基也发现WTSQR9和T7SS突变体根定殖显著降低(图3a)。
随后作者假设YukE诱导的根铁泄漏可能会影响细菌铁稳态，从而影响细菌定殖。为验证这一假设，作者通过ICP-MS定量测量了细菌细胞在接种到拟南芥根际后获得的铁含量。实验结果表明，野生型SQR9细胞中铁含量显著高于DT7、DyukE和DT7E（图3b）。为了进一步确认YukE诱导的铁泄漏是否导致这种差异，作者用YukE处理植物，然后去除植物，用所得培养基培养SQR9，随后测量SQR9细胞的铁含量。结果表明，YukE处理的拟南芥培养基增加了SQR9的细胞铁含量，而在没有植物的培养基中细胞铁含量没有变化（图3c）。这些结果表明，T7SS和YukE引起的根铁泄漏可通过增加SQR9的铁含量，帮助其在根系定殖。
图3 YukE介导的植物根部铁泄漏有助于SQR9在根部定殖
4、YukE插入根细胞膜，导致铁泄漏
为了探究YukE引起根部铁泄漏的机制，作者构建SQR9yukE：：yukE-gfp用于观察YukE在植物根部的位置。作者用染液对根质膜进行染色，发现在接种SQR9yukE：：yukE-gfp和用YukE-GFP处理的根表面24h都可以检测到YukE（图4a，b）。随后将根表SQR9细胞洗涤除去而分泌的YukE和纯化的YukE仍然附着在根上，48h后发现在根表仍然检查到较少的YukE（图4c,d）。
为了验证YukE是否会改变根质膜的结构，作者用染液对YukE、YukE-GFP和SQR9yukE::yukE-gfp处理的根表进行染色，结果发现，YukE处理的根细胞核可以被染液染色并且不会导致细胞死亡（图4a,g）。为了进一步证实YukE在植物细胞膜通透性和根铁泄漏中的作用，作者生成并纯化了多个在单个位点突变的YukE突变体，结果发现G3C、A16C、S42C、G46C、A81C和A92C的YukE突变体改变了膜的通透性并导致铁泄漏，而S23C、S38C、A53C和S67C则没有（图5a-c）。随后试验进一步验证发现YukE可以插入到质膜中，导致脂质体膜的铁释放，进而导根铁泄露（图5）。
图4 15天龄拟南芥细胞表面的YukE功能和位置
图5 将YukE插入植物质膜
5、T7SS和铁载体之间的分工
细菌可分泌铁载体螯合环境中的铁，随后将铁-铁载体螯合物运输到细胞中实现对铁的获取，为了区分T7SS和铁载体对铁获取的功能，作者构建铁载体合成或运输受阻但仍具有导致根铁泄露功能的突变体（图6a,b）。结果发现，铁载体合成运输系统对铁泄露没有影响。随后作者还发现高铁环境中(5μM和50 μM)T7SS表达显著高于低铁水平(图6c)，而在低铁条件下铁载体的合成与转运基因受到上调。这说明在低铁环境中，铁载体的功能是与其他微生物竞争铁，T7SS是一种根际芽孢杆菌暂时导致宿主铁泄漏以快速占据生态位的策略，两者具有明显的分工。
该文章以芽孢杆菌SQR9为研究对象，发现SQR9可以依赖T7SS系统在定殖早期分泌YukE蛋白插入植物根部，导致植物根部铁的短暂泄露，从而帮助其在根部定殖。芽孢杆菌在根部的成功定殖又可以帮助植物获取更多养分，促进了植物-微生物的相互作用。总的来说，本文揭示了T7SS在有益根际细菌与植物互作中的作用，展示了芽孢杆菌与植物之间“先借后还”的一种新的铁素利用机制。
论文信息
原名：Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization
译名：贝莱斯芽孢杆菌VII分泌系统导致铁从根泄漏以促进其定殖
期刊：Nature Microbiology
DOI：10.1038/s41564-023-01402-1
发表时间：2023
通讯作者：张瑞福，刘云鹏
通讯作者单位：南京农业大学，中国农业科学院
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