【LorMe周刊】黏细菌调控根际公共硫胺素控制疫霉菌侵染大豆的机制

作者：薛娇，南京农业大学硕士在读，主要研究铁载体与植物互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍黏细菌调控根际公共硫胺素控制疫霉菌侵染大豆的机制，原文于2023年发表在《Nature Communications》上。

导 读

在根际土壤中，硫胺素（VB₁）参与微生物糖、氨基酸和脂质代谢过程。由于多数植物和微生物均能合成硫胺素，胞外环境的硫胺素已被视为是一种重要的公共资源，前期研究发现黏细菌EGB与疫霉菌之间存在着以硫胺素供应为纽带的营养互作模式。研究发现黏细菌EGB通过产生一种新型硫胺素酶CcThi1分解环境中公共硫胺素，阻断疫霉菌获取硫胺素，进而抑制疫霉菌的生长。黏细菌通过CcThi1调控大豆根际环境中硫胺素的含量，控制疫霉菌群体数量进而防控大豆疫霉病 。该研究阐明了黏细菌在调控土壤环境公共营养资源中的作用及其生态学功能。

结 果

1．植物根系和根际微生物分泌的硫胺素有利于疫霉菌的生长

大量研究发现，疫霉菌属的成员是硫胺素营养缺陷型。仅利用外源完整的硫胺素分子进行正常生长，疫霉菌可以造成植物根茎部腐烂，从寄主植物中获得硫胺素，对于大豆的生产造成毁灭性的损害。但是目前对于疫霉菌获取硫胺素的机制尚不清楚。为了确定硫胺素的存在对疫霉菌生长的影响，作者选用三种不同的大豆品种（感病品种：HF-47，抗病品种：LL-9、HN95）进行生物测定和定量PCR测定大豆根际疫霉菌P6497生物量。三种大豆的根系分泌物都能使P6497在不含硫胺素的特定培养基中生长（图1a，b），并且P6497的生物量增加了约一个数量级（图1b）。根际细菌T-1有较高的硫胺素产生能力。T-1的培养上清液在不含硫胺素的培养基中恢复了P6497和大肠杆菌K-12ΔthiE（其只在外源硫胺素存在的条件下生长）的生长（图1a、b）。随后，作者发现T-1在共培养时也会促进P6497的生长（图1c，d）。这些结果表明，植物和土壤微生物为大豆根际土壤中疫霉菌的生长提供了公共硫胺素（图1e）。

图1.植物宿主和土壤微生物中的有效硫胺素促进疫霉菌的生长

2．黏细菌EGB通过分解硫胺素抑制疫霉菌的生长

为了研究黏细菌和疫霉菌之间的相互作用，作者测试了菌株EGB对P6497生长的作用。发现与其对真菌和细菌的接触性捕食不同，在不接触的平板对抗试验中EGB抑制了P6497的生长（图2a，b）。共培养的生物量结果显示，菌株EGB的共培养物液体导致P6497生物量减少25倍，但菌株EGB生物量保持不变（图2c）。EGB对P6497的菌丝体没有破坏但但是抑制了P6497游动孢子的产生，也进一步说明EGB通过非捕食行为抑制P6497的生长。

随后作者对该现象背后机制进行研究，发现菌株EGB冻干培养上清液（SUPL）与P6497菌丝体共培养时，P6497菌丝体生长虽受到抑制但具有代谢活性（图2d）；当用新鲜的10%V8培养基代替含有SUPL的培养基时，菌丝体可以恢复正常生长（图2e）。因此得出结论，菌株EGB通过SUPL中的分泌因子抑制疫霉菌的生长，但可以使疫霉菌保持活性。在SUPL处理的10%V8培养基中培养大肠杆菌K-12ΔthiE，与对照相比，菌株K-12ΔthiE的生物量降低了一半，这意味着SUPL降低了10%V8培养基中硫胺素的含量从而抑制K-12ΔthiE的生长（图2f）。与此同时，在SUPL处理的V8培养基中检测到硫胺素降解产物HET，该产物的存在导致硫胺素的分解进而抑制疫霉菌生长。

图2.黏细菌EGB通过分解硫胺素抑制疫霉菌的生长

3．CcThi1通过分解必需硫胺素限制疫霉菌生长

作者通过物质纯化与鉴定确认SUPL中存在分解硫胺素的硫胺素酶CcThi1，基于CcThi1的生化特性（图3d），作者进一步研究了其分解过程。将硫胺以2.9μM的最终浓度加入培养基中，并使用铁氰化钾法测量其残留浓度，在10%V8培养基中检测到CcThi1对硫胺素的剂量依赖性降解比在纯水中更快（图3e，f），添加CcThi14小时后的10%V8培养基无法检测到硫胺素含量，并且疫霉菌不能在该培养基中生长，上述结果表明，CcThi1通过分解培养基中的硫胺素来限制疫霉菌的菌丝生长。为了进一步确认硫胺素是CcThi1的靶标，作者选用均不能合成硫胺素的大肠杆菌突变体K-12ΔthiE和BY4743Δthi6。结果发现CcThi1处理含硫胺素的培养基显著限制了菌株的生长，CcThi1并不能抑制可以自身合成硫胺素菌株的生长。

图3.来自菌株EGB的细胞膜的硫胺霉I CcThi1通过分解必需的硫胺素来抑制疫霉菌的生长

4．CcThi1的细胞外分泌是由外膜囊泡介导的

基于以上结果，作者进一步探索CcThi1与疫霉菌相互作用有关的输出通道。外膜囊泡（OMV）是细菌从其膜上脱落的纳米颗粒，已经证明，粘细菌产生的OMV在群体间通信和对抗其他细菌中发挥重要作用。因此，作者想进一步研究CcThi1的细胞外活性是否与OMVs有关。作者收集菌株EGB的无细胞培养上清液（SUP），并通过超速离心收获OMVs组分，并测定了组分抑制P6497生长的能力，结果显示上清液中的活性成分浓缩在OMV中，而无OMV的SUP（SUPU）的活性显著降低了90%（图4a）。随后作者使用亲核试剂测量其对硫胺素的催化活性，发现与SUP和SUPU相比，85.6%的酶活性集中在OMV中（图4b），并且通过蛋白质印迹分析进一步证实了CcThi1在膜和OMV级分上的定位（图4c，d）。

由于很难对菌株EGB进行遗传操作，作者删除了模式菌株DK1622的ccthi1基因的同源基因mxthi1生成CL1003，结果发现CL1003几乎完全失去了对疫霉菌P6497的抑制效果，回补mxthi1后，CL1003恢复了对P6497的拮抗作用（图4e，f）。与菌株EGB相似，DK1622的细胞外拮抗和硫胺素分解活性主要在OMV中检测到，而CL1003中则未检测到蛋白印迹活性（图4a-c）。

图4.OMV参与膜结合CcThi1的细胞外分泌且其源于模式菌株M.xanthus DK1622

5．黏细菌通过调节根际土壤中的公共硫胺素水平来控制大豆根腐病

由于CcThi1对P6497具有良好的拮抗作用，作者进一步通过温室盆栽实验来研究黏细菌硫胺酶在大豆根际的作用。结果显示，与对照相比，接种菌株EGB和DK1622可以显著降低根腐病发病率，而接种ccthi1突变体CL1003的大豆植株发病率比DK1622更高。ccthi1基因回补的CL1004菌株对疫霉菌的限制又恢复到DK1622水平（图5a，b）。当盆栽第21天收集根际土壤进行DNA提取，通过qPCR分析不同组之间P6497丰度的变化，P6497的丰度在所有处理中都有不同程度的降低，接种CL1003突变体的大豆植株根际疫霉菌丰度高于其他处理。随后，作者在第7、14和21天对根际硫胺素水平进行测定，发现菌株EGB、DK1622和互补菌株CL1004处理显著降低了土壤中的硫胺素水平，而CL1003处理对硫胺素水平没有显著影响（图5d）。此外，硫胺素浓度与疾病指数之间存在明显的正相关关系（图5e-g）。

图5.黏细菌分泌的CcThi1通过降低硫胺素的有效性控制大豆疫霉菌根腐病

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6.黏细菌通过调节根际土壤中的公共硫胺素水平来控制大豆根腐病

基因组序列的生物信息学分析评估了粘球菌门中CcThi1同源物的流行率，生物信息学分析显示，CcThi1的同源物广泛分布在2个纲中，包括3目、3科和13属（图6a）。从Corallococcus、Archangium、Cystobacter和Myxococcus中选择了7种黏细菌与P6497共培养，结果显示，如菌株EGB一样 7种菌株都表现出显著的拮抗作用，如菌株EGB（图6b，c）。并且， CcThi1的同源物MxThi1，AcThi1、CyThi1、CbThi1（分别来源于M. xanthus DK1622、Archangium sp. SDU8、Cystobacter sp.1404、Clostridium botulinum）都表现出CcThi1活性，并在低至1nM的浓度下拮抗P6497的菌丝生长。这些结果证明CcThi1在黏细菌类群中广泛存在，是它们对抗疫霉菌的重要因素。

图6.粘细菌分类群中广泛分布的硫胺酶I CcThi1同源物对与疫霉的相互作用至关重要

结 论

硫胺素在根际环境中作为一种公共资源调节植物根际微生物（包括病原菌）间的相互作用，硫胺素对疫霉菌的生长有重要作用，本研究发现黏细菌可以分泌一种硫胺素酶，该酶可以分解公共硫胺素资源，从而减少根际疫霉菌可利用的硫胺素水平，限制大豆根际疫霉菌的生长，进而可以高效率的控制疫霉菌引起的大豆根腐病，为大豆根腐病提供一项好的防控手段。

论文信息

原名：Myxobacteria restrain Phytophthora invasion by scavenging thiamine in soybean rhizosphere via outer membrane vesicles-secreted thiaminase I

译名：黏细菌全新调控根际公共硫胺素控制疫霉菌侵染大豆的机制

期刊：Nature Communications

DOI：10.1038/s41467-023-41247-0

发表时间：2023.9

通讯作者：崔中利教授，李周坤副教授

通讯作者单位：南京农业大学生命科学学院