注：以下内容是国家自然科学基金项目（41671248）中的摘要和前言；供需要写国家自然科学基金的朋友参考。推送此文，也是因为刚刚结识了一位来自国立台湾大学的老师Nai-Chun Lin，短暂交流发现在学术上有不少共同语言和观点。
连作番茄根系分泌物促进土传青枯菌入侵的机制研究
番茄连作易发生土传青枯病（致病菌为青枯菌），研究认为连作体系下某些番茄根系分泌物的累积效应在病菌入侵过程中可能起重要作用，但其组成及贡献机制尚未清楚阐明。本项目提出番茄根系分泌物中“利病菌”、“化感”和“自毒”三大类物质，分别通过促进青枯菌根际定殖（入侵第一阶段：病菌根际定殖竞争能力增强）、抑制土著（有益）微生物群落功能（入侵第二阶段：有益菌根表抵御病菌能力减弱）和破坏根系组织（入侵第三阶段：植物抵御病菌入侵根内能力降低）等三方面促进青枯菌入侵番茄根系的假设。通过研究青枯菌利用番茄根系分泌物的特征、化感物质调控下的土壤微生物群落结构和功能特征和自毒物质影响下根系组织受损情况，确定“利病菌”、“化感”和“自毒”三类物质组成，并通过盆栽试验研究三类物质交互作物下青枯菌侵染番茄根系的效率。最终阐明番茄根系分泌物的关键组分促进青枯菌入侵的机制，为揭示连作障碍发生机制和防控土传病害提供理论基础。
1.1研究意义
植物在土壤中会遭遇到各种生物和非生物逆境，如干旱、盐害、土传病菌侵染等，植物根际微生物群落在帮助其摆脱逆境方面起到重要作用（Naik et al., 2009）。为了获取“帮助”，植物将高达40%的光合作用固定的碳由植物根系分泌到根际土壤中（Lynch and Whipps, 1990）。微生物利用这些富含碳化合物作为营养物质生长，并发挥特定功能，协助植物抵抗环境压力（Esperschutz et al., 2009；Yergeau et al., 2014）。如图1所示，正常情况下，植物遭遇土传病菌入侵或其他胁迫时，会调整根系分泌物组分和数量，进而选择性的富集能适应高度竞争性的根际环境和能利用这些特殊物质的微生物，从而塑造出具有特定功能的微生物区系来缓解环境胁迫（Bais et al., 2006；Haichar et al., 2008；Hartmannet al., 2009；Paterson et al., 2007），保障植物健康生长。
图1本研究的基本问题：根系分泌物是植物调节土壤微生物区系的重要物质媒介，在连作体系下作物土传病害发病率较高，根系分泌物是否又成为病原菌的“帮凶”？
然而在连作体系下，人们常发现作物发生土传病害的概率较高（Hide and Read, 1991；Zhang etal., 1998），说明在连作体系下作物抵御病原菌入侵的能力下降。为何在连作体系下作物根系分泌物失去了调控根际土壤微生物区系进而抑制病害发生的能力？根系分泌物对土传病原菌、土著微生物以及植物根系的影响是怎样的？是否根系分泌物中的某些组分成为了病原菌的“帮凶”，促进了病害的发生？如果答案是肯定的，那么它们是谁，具体的作用是什么？阐明这些问题，对于理解连作障碍的发生机制以及解决土传病害有重要意义。本研究以番茄青枯病为研究对象，探索番茄根系分泌物的累积对土传青枯菌根际定殖（病原菌侵染能力）、土著微生物群落结构及功能（微生物防御能力）和番茄根系活力（植物自身防御能力）的影响，从三个角度揭示番茄根系分泌物促进土传青枯菌入侵的机制。
1.2国内外研究现状及研究假说
1.2.1连作体系下土传病害发生状况不容乐观
连作障碍通常指同一作物或近缘作物连作以后，即使在正常管理的情况下，也会产生产量降低、品质变劣和生育状况变差的现象，土传病害是其最重要的形式之一（孙光闻等，2005）。受人口数量和耕地面积等因素的限制，我国农业粮食和蔬菜种植的集约化程度和复种指数呈逐年增加的趋势，由土传病害引起的连作障碍也越来越严重，对我国农业造成巨大的威胁（Huang et al.,2011；Ren et al., 2012；Xue et al., 2009）。以番茄青枯病为例，该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块的发病率为10%～15%，重病田的发病率高达80%～98.5%（卢同，1998），导致番茄产量的严重下降，严重时可造成绝收。青枯病是由茄科劳尔氏菌 Ralstonia solanacearum（以下简称为青枯菌）引起的一种细菌性维管束病害（Yabuuchi et al.,1995），属于毁灭性的的土传病害，在我国主要分布于长江以南，以广东、广西、福建、浙江、湖南和江苏等省区，当番茄连作或与其它茄科作物轮作时极易发病，一旦爆发则难以遏制，严重制约着我国番茄产业的发展（Wei et al., 2011;Xue et al., 2009）。
1.2.2连作体系下根系分泌物与土传病害发生之间的关系尚未清楚阐明
关于连作体系下作物土传病害发生加剧有以下观点：（1）作物连作提供了根系病虫害赖以生存的寄主和繁殖的场所，病原菌大量繁殖，加重了土传病虫害的发生。（2）连茬作物根系多年的分泌物和代谢物积累，会引起土壤微生物生态的变化，既影响土壤性状又影响作物生长。（3）植物的自毒现象加剧了植物吸收养分的胁迫，进而阻碍植物生长发育。以上观点中都直接或间接表明根系分泌物在土传病害发生中的重要作用。根系分泌物作为作物根际微区域生态环境的重要调节因子，在土传病害发生的过程中必然发挥着重要作用。研究表明根系分泌物的主要成分包括糖类、氨基酸、有机酸、酚酸和黄酮类等，这些物质对植物根际的微生物有不同的影响作用（杨智仙等，2014；李传涵等，1991；张勇等，2004）。其中，特殊的酚类化合物可以作为信号物质吸引有益微生物、固氮菌如根瘤菌和菌根真菌在根际的定殖，增加群落多样性（Bais et al., 2006）。番茄根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等增加了有益芽孢杆菌在根系定殖的数量，可能有助于防控青枯病发生（Tan et al., 2013）。根系分泌物除了对根际微生物数量和种类产生影响外，还对微生物的代谢及生长发育有一定的影响，其影响有时起促进作用，有时起抑制作用。前人的研究工作为我们理解连作体系根系分泌物对土传病害发生的贡献奠定了基础，总结前人的工作，我们也发现尚未解决的问题，为我们进一步深入研究指明了方向。
图2 本项目的研究假说：在青枯菌入侵番茄根系的三个阶段（土体到根际、根际到根表和根表到根内）中，番茄根系分泌物中的利病原菌、化感和自毒三类物质分别通过促进青枯菌根际聚集和定殖、抑制根际有益菌抵御、破环根系防御组织等方式，提高青枯菌的侵染能力。
问题1：影响病原菌在土壤中生存和定殖的关键根系分泌物组分尚不清楚
作物根系持续多年分泌同类型的分泌物会引起某种能利用这些根系分泌物的致病微生物的有效定殖，从而加速植物根部病害的发生（孙光闻等，2005）。那么哪些根系分泌物组分促进了病原菌的有效定殖呢？杨瑞秀等（2014）研究表明，甜瓜分泌的6种酚酸类物质对枯萎病病原菌的生长都有一定的促进作用。嫁接茄和自根茄根系分泌物中的化感物质香草醛和肉桂酸则对茄子黄萎病有明显促进或抑制作用（周宝利等，2010；王茹华等，2006）。青枯菌对某些氨基酸、有机酸以及寄主的根系分泌物有趋向性（Yao and Allen, 2006）。青枯菌受到这些信号物质（趋化性物质）的刺激后，从土体向寄主植物根际游动（青枯菌入侵根系的第一阶段）（Tans-Kerstenet al., 2001），以便获得适宜的生存环境（Yao and Allen, 2007）。青枯菌到达根际后，哪些根系分泌物组分作为养分物质促进了病原菌的成功增殖（青枯菌根系入侵的第二阶段）？土壤中有丰富多样的微生物，为何未能成功与青枯菌争夺营养资源，抑制其增殖？是否存在关键的碳源，病原菌能否优先快速利用？在本研究中我们将对病原菌有趋化作用和促进病原菌快速增殖的根系分泌物组分统称为利病菌物质。我们认为连作体系下番茄根系分泌物中利病菌物质的累积，促进了病原菌向植物根际聚集并大量增殖，使其在植物根际存活的能力增强，更具竞争力（图2，研究假说1）。
问题2：化感物质对土壤微生物的调控以及这种改变对病菌入侵的影响尚不清楚
通常认为土著有益微生物的生长受限是连作系统土传病害爆发的另一重要原因。土壤微生物群落是植物保护根系免受病原菌入侵的“益生菌团”。这些微生物在根际土壤中保护植物的主要机制在于，在病原菌入侵植物根系的第二阶段，它们会与病原菌竞争营养物质和生态位点，部分微生物还会产生抑菌物质拮抗病原菌的生长（Compant et al., 2010；Yuan et al., 2012）。一旦它们的生长受到抑制，数量降低，则土壤中与病原菌竞争的力量就被削弱，使病原菌在根际生存定殖的阻力降低，能更好更快地移动到植物根系表面，进而在合适的条件下入侵到植物体内诱发土传病害。大量研究表明，作物连作后，根际土壤微生物类群会由“细菌型”向“真菌型”转化，其中的有益微生物如氨化细菌、硝化细菌和芳香族化合物降解菌等数量随连作年限的增加而急剧下降，但土壤中的真菌数量则逐年增长，有利于真菌性土传病害的产生（吕卫光等，2006；刘素慧等，2010；Guo et al., 2011）。Li 等（2014）在研究花生连作障碍时发现，连作土壤感病的主要原因在于根系分泌物诱导了土壤微生物区系发生改变，使其中的病原真菌数量累积而有益微生物如PGPR和菌根等减少，从而发生连作障碍。目前从根系分泌物中发现的有酚类化合物、阿魏酸、氢氰酸、苯甲酸、肉桂酸和皂角苷等物质都对土壤微生物生长起抑制作用，这类物质一般统称为化感物质。那么在连作土壤中，番茄根系分泌物中化感物质累积后土壤微生物群落结构和功能有何变化？物种和功能多样性是否下降？我们认为根系分泌物中的化感物质会抑制根际有益微生物生长，破坏土壤微生物群落结构和功能，使其抵御病原菌入侵的能力减弱，病原菌在根际的竞争阻力减小，易于侵染植物（图2，研究假说2）。
问题3：自毒物质对植物根系的破环与病原菌入侵的交互作用尚未清楚阐述
单一作物连作体系中，自毒成分的积累被认为可能是引起连作障碍的重要因素之一。自毒作用是植物个体通过根系向周围环境释放一些特殊的代谢产物和化学物质（根系分泌物），抑制其他植物生长的现象，一般发生在种内（喻景权和松井佳久，1999）。常报道的根系分泌物自毒成分主要有脂肪酸、有机酸类和酚酸类物质，如苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸和水杨酸等（Asao et al., 2003；邹丽芸，2005；周新刚和吴凤芝，2015）。该作用发生的机理在于通过影响植物的细胞膜透性、根系活力、酶活性、呼吸作用和光合作用等途径对下茬的植物生长产生抑制作用（张晓玲等，2007；王茹华等，2014）。目前大量研究集中于分析检测自毒作用发生之后植物的生理响应，而对于作物抵抗病原菌入侵的能力的改变研究较少，有关两者之间的因果推论尚未证实。事实上，植物抵御土传病原菌入侵的最后一道防线是根系组织。青枯菌一般通过破环植物根表的防御系统比较弱部位（根系伸长区、新生鞘或侧根）或植物的伤口或天然裂缝进入寄主根内。我们认为根系分泌物中的自毒物质损伤了植物根系细胞膜通透性和根系活力，使其抵御病原菌入侵的最后“防线”破损，难以阻碍病原菌的入侵，最终加剧土传病害的爆发（图3，研究假说3）。本项目将深入研究回答以下问题：番茄根系分泌物中哪些组分为自毒物质？在自毒物质作用下，根系组织生理活性发生了什么变化？这一变化是否有利于青枯菌入侵植物根系？
1.3研究出发点
植物通过向土壤中分泌各类化合物来吸引各类有益微生物来抵御病原菌侵染（Rudrappa and Bais, 2008）或应对养分缺乏（Dimkpa et al., 2009）等胁迫。在前期研究中我们发现前茬作物为番茄或其它茄科作物时，当季番茄都会发生连作障碍，青枯病的发病率较高（图3），其中连作番茄发病率达70%，表明番茄根系分泌物应对胁迫的能力下降。在前期研究中，项目申请人着重于番茄青枯病的生物防治，已筛选到具有一定防控效果的拮抗菌，并深入研究了拮抗菌定殖和拮抗机理，从而阐明拮抗菌生防机制。然而，研究过程中，根据前人结果发现拮抗菌在大田防效试验上的效果不稳定（Wei et al., 2011），原因可能在于我们对土传青枯病发生的过程和机制认识较少，不了解连作之后根系分泌物组分变化和根际微生物群落改变等，使得拮抗菌在施入土壤后的存活和功能发挥存在不确定性。因此，本研究拟根据图2中3个假说设计试验，考察根系分泌物调控土传病原菌入侵植物根系的机制，全面系统地阐明两者的关系，为土传青枯病的防控增加理论基础。
-The End-
南京农业大学根际微生态与调控实验室，
Lab of rhizospher Micro-ecology & Management
开展根际微生态研究，致力于调控根际环境，
立足本土需求，面向和走向国际化。
竞争求发展，合作谋共赢。
Competition & Cooperation。
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