作者：陆春霞，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌与噬菌体的共进化。
近年来，随着抗生素的滥用，细菌耐药性随之增强，导致了“超级细菌”的出现，新药研发的速度远远跟不上耐药性出现的速度。在这样的背景下，噬菌体作为能侵染细菌的可进化生物体，在治疗细菌性疾病的问题上得到了广泛关注。然而在噬菌体治疗过程中，细菌抗性的出现可能会削弱噬菌体的治疗效果，如出现对多个噬菌体的交叉抗性等。考虑到噬菌体能对细菌产生反防御，因此本文提出通过共进化来筛选驯化的噬菌体，来应对过去的非进化细菌，以期形成“先发制人”的优势。
细菌在λtrn处理下抗性出现更慢
作者选取了大肠杆菌REL606、原始噬菌体λunt(感染受体：LamB)及通过28天共进化筛选到的驯化噬菌体λtrn(感染受体：LamB、OmpF)作为实验材料，进行共同进化30天来并比较共进化细菌和噬菌体的种群动态，发现不同处理下, 噬菌体数量差异不大，大肠杆菌在噬菌体λunt处理下仅3天就不再抑制其生长，而在λtrn处理下，13-28天均能看见明显的抑制效果(图1)。这一结果表明λtrn对细菌具有长期抑制效果，即细菌对λtrn的抗性比对λunt的抗性出现的更慢。
首先确定每个处理抗性出现的时间，对各处理每5天分离的12个单菌落与原始噬菌体(λunt或λtrn)液体培养，通过微量滴定板读取器来跟踪细菌种群生长，比较OD值变化来表征12个分离菌中能抗原始噬菌体的比例。结果如图2所示，在第3天时，λunt处理下的菌一半以上对λunt有部分或完全抗性，到第10天时，细菌能完全抗λunt。而λtrn处理下，抗性出现的时间明显延后，且表现的更可变，如重复1、2(图2D、E)在共培养30天内几乎没有出现完全抗性细菌，重复3(图2F)在第20天细菌表现出完全抗性。
图1 细菌(A)和噬菌体(B)在培养30天期间的种群动态；青色为λunt处理，红色为λtrn处理，线型表示重复
图2 在共进化实验的不同时间点，细菌种群对来自各个处理的原始噬菌体的敏感(蓝色)、部分(黄色)和完全(红色)抗性比例(n=12个菌株/时间点)；图A–C表示λunt重复1-3和图D–F表示λtrn种群1-3
细菌需要多个突变位点来对抗λtrn
通过对抗性最早出现和发生明显变化的时间点的代表性菌株进行全基因组测序，作者发现在λunt处理中似乎只有malT一个假定突变位点，而λtrn处理中有八个假定突变位点，大多数位点在之前的研究中未发现影响噬菌体的侵染。
同时在确定每个细菌分离物中发生的假定抗性突变后，作者量化了这些突变是如何影响噬菌体抗性的。通过使用主成分(PCA)中的PC1作为抗性指标来进行线性回归，以测试假定抗性突变数量与原始噬菌体抗性表型之间的关系(图3)。结果发现该关系对λunt和λtrn都是显著的，且λtrn的高水平抗性依赖于5个假定抗性突变点，而相比之下λunt只需一个突变点就能产生完全抗性。这一结果表明，要对λtrn产生完全抗性，需要多个突变点来实现对λtrn的完全抗性。而图4对抗性进化成本研究的结果显示，进化多个突变位点(抗λtrn)所需的成本相较于进化一个突变位点(抗λunt)高，这也就解释了为什么细菌在λtrn处理下抗性出现的更慢。
图3 假定抗性突变数量与噬菌体抗性水平之间的关系(PC1表示抗性)：图A、B分别表示与λunt和λtrn的共同进化处理；细菌菌株标记为“处理−重复−分离时间点−分离第几株−抗性状态，其中S为敏感，R为完全抗性，P为部分抗性
图4 共进化细菌分离物相对于其原始REL606的适应度：与λunt共进化的菌株为青色，与λtrn共进化的菌株为红色，细菌标记同图3
针对抗性细菌，λtrn提高了其进化适应力
在研究了宿主细菌对两种噬菌体的响应后，作者从噬菌体的角度来评估其反防御对细菌的影响。通过读板实验，以确定共现噬菌体(共进化时间点分离的)与原始噬菌体相比，是否进化了抑制最早抗性细菌出现的能力。结果如图5所示，发现λunt共现噬菌体在抗性宿主上并不比原始的好，而所有λtrn共现噬菌体都比其原始λtrn更好地抑制共现抗性宿主。这一结果说明驯化噬菌体除了能够延缓宿主抗性出现的时间，还能对抗性宿主有较好的适应性及抑制能力。
图5 共进化的λtrn共现噬菌体对抗性细菌的适应性和更好的抑制作用；红色表示祖先噬菌体λtrn，紫色表示共现噬菌体λtrn
λtrn通过重组来获得其抑制能力
接下来作者研究了驯化噬菌体之所以能够抑制宿主进化的机制，发现λtrn突变体中有一区域(未知～1300bp)经历了49次突变，可能为λtrn的基因(1545-2796bp)与宿主细菌REL606基因(882-2217bp)的重组结果(图6A)。
通过将等位基因和基因标记插入λunt中，来验证是否重组使驯化噬菌体获得了其抑制能力。竞争实验结果(图6B)表明重组提高了λunt与野生型(REL606)、malT−、malT −ompF−宿主细胞竞争的能力。同时作者还发现，通过重组，过去感染的残余DNA为提高当代噬菌体的繁殖能力提供了信息。由此展示了噬菌体-宿主重组在噬菌体培养中的潜在益处。
图6 A. 宿主基因组中三种噬菌体的宿主识别基因型和残余原噬菌体基因(ECB_00511、ECB_00512和ECB_00513)的示意图，黄线表示点突变，深绿色框表示ECB_00512的组合段，浅绿色框表示相邻的原噬菌体基因没有重组；B. 当竞争三种不同的大肠杆菌基因型时，重组λ的相对指数增长率，字母(i和ii)表示统计上相似的组，虚线表示重组后的生长速率等于重组前的位置
本文通过比较原始和驯化后的噬菌体与原始宿主细菌共培养，评估了驯化噬菌体作为一种提高治疗效果的方法的前景。结果发现，与原始噬菌体λunt处理相比，驯化噬菌体λtrn处理可延长宿主种群的抑制，并且λtrn抗性的进化被延迟。导致这一结果的原因主要有：(1)细菌需要突变多个位点才能完全抵抗驯化噬菌体λtrn；(2)细菌对λtrn的抗性突变会带来巨大的生长成本；(3)噬菌体λtrn相关基因重组，使得其具有更强的适应力来对抗性细菌做出反应。全文主要通过揭示驯化噬菌体在共进化中的优势点，为噬菌体治疗提供了新的思路和见解。
论文信息
原名：Coevolutionary phage training leads to greater bacterial suppression and delays the evolution of phage resistance
译名：共进化的驯化噬菌体导致更大的细菌抑制并延迟噬菌体抗性的进化
期刊：PNAS
发表时间：2021.03
通讯作者：Justin R. Meyer
通讯作者单位：圣地亚哥加利福尼亚大学分校生物科学系
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