针对癌症的治疗性疫苗主要针对分化抗原、癌睾丸抗原和过表达抗原，迄今为止几乎没有产生临床益处。多个小组进行的研究表明，识别新抗原的 T 细胞存在于大多数癌症中，并为个性化疫苗接种提供了一个特异性且高度免疫原性的靶标。
我们最近开发了一种使用肿瘤浸润淋巴细胞来识别患者肿瘤中表达的特定免疫原性突变的方法。在这里，经过验证、定义的新抗原、预测的新表位和驱动基因的突变被连接成一个单一的 mRNA 构建体，为转移性胃肠癌患者接种疫苗。
该疫苗是安全的，并引发了针对在接种疫苗前未检测到的预测新表位的突变特异性 T 细胞反应。此外，我们能够分离和验证靶向 KRAS G12D突变的 T 细胞受体。我们观察到在该试验中接受治疗的 4 名患者没有客观的临床反应。
这种疫苗是安全的，未来应评估此类疫苗与检查点抑制剂或过继性 T 细胞疗法的潜在组合，以评估常见上皮癌患者可能的临床益处。
I/II 期方案（NCT03480152）获得了 NIH 的 IRB 委员会和 FDA 的批准。
临床研究中心，NCI，NIH。
针对传染病的保护性疫苗接种已被证明是医学上最有效的健康措施之一；然而，事实证明，针对持续感染和癌症等既定疾病的治疗性疫苗接种更具挑战性。癌症疫苗旨在针对可以引发针对癌细胞而非正常细胞的选择性免疫反应的抗原。直到最近，针对非病毒性肿瘤的治疗性疫苗主要针对分化抗原、癌睾丸抗原和/或过表达抗原，但几乎没有临床影响 ( 1 )。
近年来，我们小组和其他人广泛研究了新抗原作为免疫治疗靶点的重要性（ 2-7 ）。现在很清楚，新抗原特异性 T 细胞存在于大多数癌症中。源自体细胞突变的新抗原为疫苗接种提供了一个特异性且高度免疫原性的靶标，最近发展的快速且相对便宜的 DNA 测序技术促进了这些靶标的识别 ( 2 )。
最近的几项研究报告了用新抗原疫苗为黑色素瘤患者接种疫苗 ( 8 – 10）。尽管可以针对这些试验中评估的候选新抗原子集引发 T 细胞反应，但功能验证，包括分析 T 细胞识别自然加工和呈递抗原的能力，仅针对有限数量的反应性进行。尽管这些试验证明了此类疫苗的可行性、安全性和免疫原性，但缺乏其临床疗效的明确证据。能够编码多种肿瘤相关抗原的免疫原性疫苗接种平台可以在个性化环境中制造，这对于为常见上皮癌患者开发新抗原疫苗至关重要。此外，相关和免疫原性的疫苗新抗原的选择仍然是一个主要障碍。这里，我们开发了一条管道，用于选择由自体癌症表达并被患者的肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 识别的已确定疫苗新抗原，这些淋巴细胞 (TIL) 对其免疫原性进行了功能测试。这种名为 mRNA-4650 的疫苗由编码多达 20 种不同抗原的 mRNA 骨架组成。除了定义的抗原外，疫苗骨架还包含通过自体肿瘤的外显子组测序鉴定的 TP53、KRAS 或 PIK3CA 中的任何突变，以及多达 15 种预计与患者的 MHC 等位基因结合的 HLA I 类候选新抗原。我们在临床试验 NCI-18-C-0072 下为患者接种疫苗，并评估了个性化 mRNA 疫苗的安全性、免疫原性和临床疗效。
在 2018 年 3 月 29 日至 2019 年 11 月 13 日期间，四名转移性胃肠 (GI) 癌患者接受了编码自体癌表达的新抗原的 mRNA 疫苗治疗（见 CONSORT 图图1）。每个患者的基线特征列于表格1. 所有患者都被诊断出并接受了多种药物的大量预处理。4 名患者中的 3 名（患者 4251、4271 和 4303）之前接受过 TIL 治疗。两名患者（4251 和 4271）之前接受过抗程序性细胞死亡 1（抗 PD-1）药物。患者接受了一种 mRNA 疫苗治疗，该疫苗编码由自体癌症表达的特定新抗原、表达的驱动基因突变和 HLA-I 预测的免疫原性突变的组合。图 2A）。为了识别确定的抗原，收集了转移性肿瘤，并培养了 TIL 以供将来测试。对每个切除的肿瘤和成对的 PBMC 样本进行测序以鉴定肿瘤特异性突变。如前所述 ( 2 , 11 )，自体 TIL 识别的新抗原通过使用覆盖所有突变表位的长肽和串联小基因 (TMG) 的高通量免疫筛选来鉴定。除了定义的抗原外，我们还包括了 TP53、KRAS 或 PIK3CA 驱动基因中的任何突变，以及多达 15 个计算机预测的 HLA-I 潜在新抗原。由 25 个该系列的 25 个说唱组合，每 12 天转为两次，以电子形式制作，基于 TMG的作品。准备好，中心疫苗会被接种，在疫苗接种，每周 4 次接受临床患者 22 次每周接种和 4 次疫苗接种。患者 451 和 427 0.13 mg mRNA 疫苗治疗患者451和4279和 403 接受了 0.39 毫克疫苗。在所有 4 名患者中，我们观察到 1 级和 2 级毒性迅速消除，没有 3 级或严重不良事件 (SAE)（补充 1；提供补充材料；https： //doi.org.org/10.1111）。如图所示的图2，表属性 15% 潜在新媒体是 CD 24位，41% 是 CD 24 位，41% 是2F）。病例号为4251号患者为421个，4289号为621个（图为2G）。
( A ) 用于选择疫苗的血管示意图。( B ) 基本的多联体疫苗结构。( C ) 提供和监测概述。W n，周数。( D ) 临床试验进展的患者所有患者的新性质CD8 + 4+及时的临床表现。_发现的新反应的数量。
参与年龄的患者是4251 号患者，45 号患者，被诊断为在他的胆囊细胞。 25 号患者是我们的中型男性实验性实验性反应的细胞。 12之前）在初筛中临床了四个定义的新发现中心：HRNPU520I RNF4132N和TRAFD1 R11L 。患者476 过 51 的应用、接受数据集未驱动该基因组 22 患者在NI专用体治疗细胞采用多种治疗方法，为我们提供了一种治疗方案，并组合了一组数据表 15 由 HLA-我选择了一个 HLA-19 个表位，并制作了一个疫苗。 2）。患者接受了 0.13 mg mRNA-450 疫苗的免疫接种，并评估了 T 对细胞肽的原免疫反应。评估 mRNA-4650 的免疫性（补充图 1），在疫苗前后收集单采然后，通过我们覆盖所有细胞表的自体细胞的 25 mer 的自体 DC 刺激从细胞生产前和生产后 PBMC 的 10 天，或用 10 天，或用编码相似序列的 TMG 制造体转染，进行三层巧克力 (IVS) 用于那些产品。对从疫苗前采血获得的 T 细胞反应性分析显示，T 细胞识别 RNF213，这是先前治疗的 TIL 发现的新存在的其中之一，代表可能持续存在于外周血中的 T 细胞的反应。 24 种到 3 种 CD 和 3 种 CD 4 （L4 4种，10002888014）的反应。各种轮盘观察我们在另外发射3次到次次CD4（ OR10H1H4 ）、ITICD4）和NCAPD3D对新宇宙的评估。性，根据在性能力激活后上调他们的性，BB 4-性T 进行我们1 观察到我们的CD 1 和CO 63 观察到我们的CD 1 和CO 6 3 新地方性和新的反应性和刺激性CD 8而loc1000288014细胞细胞滴定剂量和和和和和肽肽表现出的的反应反应反应反应反应。。。。。。。。反应。。。。。。。。。。。。为了分析突变特异性突变特异性突变特异性突变特异性细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞) 和电视剧，显出性TCRαTCRα链序列。用COL6A TCR的逆序介导引导的用户图421的PB的反应性分析，显露了对透明CRα体的影响WT肽的识别。图4B）。进一步分析表明，COL6A3 和 OR10H1 反应性 T 细胞分别受到 HLA-B35:01 和 HLA-A03:01 的限制（图 4C）。
（一从外周血单核）细胞中阳性选择T细胞，并使用转染G载肽的DC。单独的DC载肽进行或有单反。然后用的DC重新刺激IVS肽培养物，疫苗使用 ISPOT 广泛表达或通过 4-1 BBOT 表达或 IFN-γ 并通过 EL47提供了应用前、应用前、后 TMG 再后的类型检测数据。反应定义为 IFN-IFN- γ和44-1BB 至少 3 倍积极表达与 DMSO 的反应水平。都用黑色箭头表示。装载的WT或代表替换肽（Mut）自体DC共18小时。通过4-1个细胞上调的流式细胞术测试2个长电池中具有实验性的BB（结果）。
4251 到患者 4251 接种疫苗后，CD8 的其他反应，但我们的疫苗接种导致 CD4 T T 的刺激对患者 427 的 TIL 患者进行活动，该患者是 37 + 37 岁的观察者。的男性，接受了针对新性别的 T17 接受治疗，后来接受了新的性反应。 CD8)、WDFY1 E44K ( CD8)、DHTKD1 V64K ( CD8)CHD2 K133I R ( CD4 )和 USP71 F156L (CD4)。该新特性包括在适当的时间（WDF 3Y1）和患者接受的 mRNA 0.13 4650 疫苗。USP471S （图5A ）的反应性，这可能代表TIL治疗后持续存在T细胞的反应，以及对2种新性反应，TP53和1S（图5A）虽然在最初的筛选中发现，我们无法对 T 细胞进行分类和扩展以评估它们的 WT 识别和肽滴定，但 T 细胞对另外 6 个它的 CHD2、HPS3 、NBPF8、BTNL8、PCNXL2 和FAMA 的反应是（图517 次到28 种患者在前 4 次接受后的检测）针对 HACE 和 SYDE1 的5A组的性图。——进一步的 WTPF888 和 F172A——1DE NB 的验证体而不是 F 1，，2 2 种 HPS3 和 SY 肽（生产 5B——产生和相应的肽）图。T细胞在DC重新进行刺激HACE1、我们用PF8 F和HACE1 、我们的性T细胞。然后，我们对NB细胞进行了7个分选后刺激反应，并进行分选的T细胞。 TCR 的 VB 才能有才华。TCR 影片分析，只有在发现有效后，才有新的应用。图。 尽管我们展示了最初的 5C对VB的筛选，但在 4 次 C 检测中没有对 KRAS 的影响。之后从患者 4271 中分开的 T 细胞接受了 10 天的 IVS，其中包括 KRASG1KRAS2D1D测试有MG或全长KRAS2D制造体。细胞培养产品的长长的产品对我们的细胞培养反应1 用 2D 的 D 的结果来衡量。 图 6 A ，共培养物的性。图 6用KRAS G +12D肽重激励单并物分选4-1BB+ 66种细胞仪进行细胞培养进行细胞以T细胞（4种细胞为CD） 。TCR 的 TCR （图 6D），合成、短片和逆向广播电视转导到不同的 TCR 和 TCR 不同的电视转播链（PBL 14 14）。TCR 的目标和浓度KRAS 共培养婴儿，4 个 TCR 社区发现 KRAS G12D新表位而不是WT序列。图6D）。
（一从外周血单核细胞中反选择T细胞，使用TMG转染或载DC的DC进行肽段。单独的DC用IVS用IVS进行。然后用载物单的DC重刺激刺激。通过流式传输1BB上ELISPOT定义4-检测或干扰素检测式细胞通过技术。提供应用前-4种后肽再刺激8种后的数据。和广泛的IFN-γ反应和为4 -1BB 或 OX40 表达积极的 3DMSO 对照组水平。所有反应的都用黑色箭头表示。通过流式细胞术对细胞中的真实识别进行，以一个检测与一个实验-1的结果进行测试。（C测试测试1个） ) 全新推出4-1个新的电视节目，将电视节目组播到电视节目中，并在节目组中将TCR组播96个节目组，并送出CR并显示。性细胞的频率。
( A ) T 细胞从 PBMC 中阳性选择 RNA、使用全肽 DC 进行 KRASMG 或载肽 DC 进行。T 细胞或用 12D 肽 (LP)、DMSO 或 PMA（长 KRAS）的 WT自体 DC 刺激 IVS 培养物。ELISPOT/流法检测 IFN-γ通过细胞式（4-1A） ） 上调（ B ） OX40 上调（B） 的反应性。（C） 再刺激细胞后按4-1A （TCRBBVαVα细胞TCRBB调D导Vα链）的TCRVβ自分TCRVα和TCRVα对将TCRVα和TCRVα对压缩到96个逆向载体和载体载体。 PBL 中，并测试与不同浓度的 KRAS G12D或 WT 长肽负载反应的自体 DC 的性。
前肠性2患者的良好安全性，mRNA- 45600疫苗接种量为0.398毫克。这个年龄段的女性患者是0.398名，她是一位女性直肠癌的患者。对新的 TIL 有反应但没有TIL的TIL反应性试验，他是我们唯一在接受 TIL 的试验前接受TIL的患者。），驱动基因与驱动基因（APC A1444fs和PI（CA D162））的2个性（APC A1444fs和PI）（APC D162）的2个性（APC ）和15个（4个）的新表一起，包括在2个和7个（含7个）中的新性。中，前前行的新表位反应似乎是唯一针对 RAD21 的，但在用户 T 中观察到的反应性相反，这种反应性似乎在 CD8 和 CD8 之间而不是 CD4 隔（图7 ）在 9 种疫苗之后，我们共同确定了 4 种被扩展的 T 细胞肽或 TMG 刺激的 T 细胞肽识别的潜在新途径（图 7A）。测试基于响应刺激而上调 4-1BB 并 OKT3 刺激的培养物针对两个 CD8 表（SPATA31D1-2 位 SPATA31D1-2 位提供一个 CD（FTCD4）的状态和反应性、APC 和7B位和反应性图）。另一种。T细胞培养物显示出对TASP4 + T细胞培养物的反应性，但只是在高浓度肽下。还针对预测的HLA-I肽库筛选了TMGVS培养物，这揭示了针对OR52D1的8A ）同样，我们从每一个新的收集和收集性 1 和1 T 的细胞培养创建图- 4 从 PBMC 的新收集和收集性 + 细胞，对象样本和参与者的 PBMC 的另一个样本和样本PBMC 存在 2 个新的 CR 样本中发现文件夹（ OR52D1和 SPATA3D1 的样本发布后频率搜索）。
名患者的另一种直肠癌试验患者（430名患者，该参加试验的5名患者。3名患者）添加9名疫苗，为0毫克。患者接种了一种mRNA疫苗，该疫苗由新的11名患者（RBM42 ) 检测的子组基因组、KRASeq 2 种驱动和我们之后的 TP53 预测和 16 种潜在的外周新生和新组成。对先前存在的或新的反应性的刺激。
在这项工作中，我们测试了一种新型的疫苗性转移和免疫原性预测，该疫苗确定了新的基因性和免疫原性预测，以及 HLA-I 表位。本试验未达到最大但未达到标准（MTD）的最大程度为我们在 0.39 观察到的。我们没有观察到严重的副作用。虽然我们没有观察到严重的副作用。虽然临床，4 名患者中有 3 名，可以同时检测到CD8初试的新名字和基本的T +设计细胞试验。000.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.000.00.00.00.00.00.00.00.000.00.00.000.00.00.00.00.000.00.00.00.00.04 Moderna已经进行了详细的清除试验（并且是第 004 段），我们跳过了 0.004 段，10.13 开始了。2 名患者接受了 0.13 mg 的治疗，因为现在的治疗方式，Moderna 消失了，我们继续进行 2 名患者 0.39 mg 正在临床使用。由于没有观察到临床反应，Moderna 目前正在使用抗 PD-1 药物的组合进行治疗结合使用 TIL 培养功能的确定的部分新物质进行临床试验的 II在患者中，均未观察到中包含的特定任何新抗原对不同特异的 T 细胞频率。在一些患者（4251 和 4251 和 4251 和 4251 进一步观察1）中，确定的新人来自我们但他们的当前存在的免疫力，治疗范围没有任何确定的急性期在患者。4251 和可能42 可能是所有新的 T 细胞都在 PBMC 中进行分析，因为我们的疫苗可以检测到 1 个细胞。由于大部分中组织组织中的 T 细胞库（1115 ）因此，MC 分析可能会产生，PB 可能会在新的肿瘤内治疗 T 细胞库。此外，它存在于早期早期持续存在的 T 细胞可能存在425 (WDF1) 和 USP47 和 427 (WDF21 和 USP47)此外，作为一种细胞培养物，可能是 TIL 的细胞性分泌基因表达过的 TIL。另外，作为 TIL 的细胞，在接受磷酸盐治疗之前，可以和氟达拉治疗淋巴癌的条件良好T 内新源和这些新 T 细胞库并延迟CD8 +的出现细胞。我们在药物方面可能会因为T 细胞反应后未观察到其他性或其他临床或物理方面。
有趣的是，尽管使用了 HLA-算法，我限制了肽的普遍表现，但主要报道了我们的反应 CD4 +和CD8 +，但之前有其他类似的工作，而不是人的行为（10人）。源性肽主要抑制 HLA 位点，可能看起来更能促进 CD4 表型细胞的表达现象，这些活性肽可能是活性肽+的表达水平，但可能会在反应的组织中产生高蛋白。 CD4 + T 细胞上细胞可能呈递递细胞（APC）并刺激 CD4 + T的性质也更可能。CD4 + T 细胞的性质更广泛，比CD 细胞的性质更广泛，这比 CD 细胞的性质更广泛。 ，可能有患者参加 PBMC 的活动，但在参加实验的同时没有观察到我们临床的频率。 图试验5 名 5 名参加试验的人至少有一次 4 次的（见 CON SORT ）。尽管筛检患者对患者的真实反应性，将是限制性的，一种适用于临床的新方法，另外，已鉴定的临床治疗似乎是一种新的有效的治疗方法。因此，我们的试验可能使用更便宜的方法来选择未来或潜在的新功能。开创的新现实。在那种情况下，细胞已经在细胞因子存在的情况下受到刺激，因此失去了它们的最初表型。
历史上作为多种药物的疫苗在根基上，各种患者的既定肿瘤方面并不有效（1），最近发表了新的急性乳腺癌中原性免疫治疗（16种母细胞瘤），包括观察疫苗的效果很明显。但在目前的如试验中，肿瘤并没有缩小，这里的免疫原原性了用疫苗（其他免疫调节剂）联合治疗。上皮癌患者的细胞。这种mRNA新病毒也可能用于细胞再生T细胞来使用新细胞的继发性T细胞治疗。
没有使用这些统计方法来预先确定样本量。
该临床试验中靶定 mRNA-4655 转移性肿瘤患者的临床肿瘤性、肿瘤性或泌尿反应系统转移性、转移性黑色瘤、转移性或泌尿素系统转移性。患者接受了肿瘤切除术和治疗组手术。根据该手术组进行手术治疗和手术组手术单我们（5）。 一直以来，IL 一直以来都被显着延长，并且整个细胞持续增长，并且每天都有 TIL 5×10×10 次。 HLA分子的结合和到/选择了60种驱动，以40种预测的新产品-44位新品。Modernmer的25位电子传输表的最终缺失序列方式用于N N N N的产品。患者每 2 周接种一次疫苗，共 4 个周期。患者均至少接受 1 个测试（每周一次）。
RNA 启动子并过磷酸钙，然后与 5'-UT 聚合、3' 多表位连接体、3' 端聚合、OR 端在端面和端面，并实现高性能。 mRNA 是通过柠檬酸缓冲液（17）。mRNA交换到通过柠檬酸缓冲液（17）。 ° C下储存。水/羟基），通过注射纳米磷酸盐进行mRNA的混合调制。调节pH后，将含有mRNA的LNP缓冲液交换为93 mM Tris、7%丙二醇（PG）、1 mM亚羟基磷酸盐三五胺(DTPA) 哭，并在 –20°C 储存使用。粒径和包率分别小于 100 和 80%，内以下低于 10 EU/mL。
用AIM-V培养基（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific）将单放品、并重悬至5×10 6到10×10 6个细胞/mL，并培养1.75×108到2×10 8个活细胞在37 ° C的T-175烧瓶（Corning）中。2小时后，将烧瓶用PBS洗涤至3次收集非贴壁T细胞用T细胞分选含有T细胞的DC细胞培养基，含有3%人血的PMI 、100U/mL、100μm、链、谷氨膜贴2g/mL /mL/mL GM-CSF/mL GM-CSF （白细胞素和200加入U/mL IL-4（PeproTech），在5% CO 2中在37 °C下介）.在第 4 天或第 5 天，细胞并新鲜使用或冷冻进一步使用。将 DC 板提供到低浓度 12 孔或孔中，用于孔中，用于加载或 TMG 转染肽。对于加载 DC加载 10 至 15 μg/μL 肽之前或库 2 。 TMG 小时电转染，在 IVS 将用 RNA 转染，将细胞用于 8 至 12 。通过 PBS 洗涤收集 DC，然后在 5 mL.9 mM ED- PBS中针对选择5个。DC细胞以5×5个细胞/mL/mL进行洗涤，并以5× 5细胞/mL的浓度瞬间悬浮。CD3（Miltenyi Biotec）对PBMC进行阴性、计数、计数和旋转。将T细胞以2×10 6的浓度重悬浮在CTL培养基中将 60 ng / mL 的 IL-21 添加到 T 细胞级分中（导致添加 DC 后的最终浓度为 30 ng/mL）。DCs 与 T 细胞以 1:1 (vol/vol) 的比例将导致（4:1 T /DC 比：1 × 1 6 T /2.5 × 1 0 5 DC）。500 微升细胞混合物转移到 48 孔板的混合孔细胞中3 7°C 72第一次补料，显微镜下观察细胞，每孔加入500 μL温热的CTL载体，小时含60 ng/mL IL-21和3000 IU/mL IL-2（培养基中的终浓度）对于在37°C下添加72小时第二次补料，含有60 ng/mL IL-21和3000 IU/mL IL-2的1 mL CTL培养板12孔板的全部温度。将旧板各孔的细胞和培养基转移到新的12孔板中，培养48小时。第三次喂食，将含有60 ng/mL IL-21和3000 IU/mL IL-2（培养）基中的最终浓度）的 2 mL 温 CTL 细胞培养基添加到 6 个孔板的每个孔中，将 12 个孔板的孔板中的细胞和培养基转移到 6 个孔板的孔板中的新孔中。并将细胞培养72小时。在此步骤之后，细胞保存在含有30 IU/mL IL-2的CTL培养基中。
使用塑料生成物之法( 13 14 )单核细胞衍生物的成熟DC。简而言之，将自体单品解冻、洗涤、用AIM-V培养基（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific）重悬至 5 × 10 6至 10 × 10 6 个细胞/mL，以大约 1 × 10 6 个细胞/cm 2在适当大小的组织培养瓶中，然后在 37°C 5% CO 2中培养。120 后，收集非壁细胞，用 PBS T 剧烈洗涤，将壁 T 细胞与含有 5% 人瓶血、100 U/mL 青瓶血、10 μg/mL 的 RPMI（Life Technologies，Fisher Scientific）一起贴链霉素，2毫米l-谷氨三细胞到0毫升/800 IU粒细胞巨细胞CSF（GM-CSF和80 U/mL IL-4）（PeproTech）（PeproTech）第4天第7天，收集了新鲜的DC。在最初刺激后第4天和第5天的实验中使用新鲜或冻融的DC。
根据制造商的建议，AllPrep DNA/RNA (80204, QIAGEN) 的基因组、新鲜肿瘤 (FrTu) 的基因组来自 DNA 和总和以及来自患者的 4213 和 4213。使用 SureSelectXT获得匹配的正常单标标系统（5190-8646，诱伦科技）与人类编码全集外显子V6-8863，安科技科技结合，打造全外文库和外捷伦子显像（51个子9个）约20,000个000集。下一个桌面使用3个WES（Illumina）的方案制造DNA容器（Illumina）上对文库进行容器组织Seq。按照500/550个DNA容器的组配文库。按照FrTT的5000/550个方案组创建文库。）（FC-404-2004，Illumina）使用试剂/流通池试剂）的v2盒。另外，根据制造商的方案，使用总RNA 2 μg和Illumina TruSeq RNA Stranded Library Prep Kit制备RNA-Seq文库。500000000000000000000000000 万个
使用 bcl2fastq 软件（转换软件）对设备格式的使用进行解复用并进行复用。( 19 ) Trimmomatic 的输出提取质量并删除FASTQ。外显子组扫描与hg 比对（21 个）。可见基因组（GATK）最佳实践协议进行了组分析。使用 Strelka、Somatic Sniper、Varscan2 和 Mutect 调用外显子组单缺失变体（SNV）。使用 Strelka 和 Varscan2 插入和删除（在/D中）。个或更多调用该变体。对于来自 Dels 的新细胞中/除了没有调用者的标准外，标准相同。使用引用 RNA 变体，对最终值。参考数据库（RefGene [RefSeq Gene]，合奏和UCSC）。所有脚本的最终结果都符合标准以及在脚本中所有脚本的结果都更改了内部数据库（COS）的结果，无论结果如何，python 12 生成 25 个用户，12 个由于某个时间地点可能会发生这样的事情没有进行更改，可能对 cDNA 序列进行相应更改，然后再增加一个新的前一个（如果）以及表后的所有 aa，直到遇到第一个密码子终止。位包含所有可能的事物。
使用PHLAT生物信息学算法（https://sites.google.com/site/phlatfortype）从外显子肿瘤样本、外显子正常样本和肿瘤RNA等位预测患者的HLA）。如果预测基因存在差异，运行每个 HLA 的前 2 个最常预测的基因座。然后将通过 netMHC pan-3.0 生成一个最小的 25 mer 的每个 I 类 HLA，并生成 8、9、10、11 和 12 mer 的长度II 类 HLA，25 个 mers 通过 3 netMHC panII-1.1，并产生了 10、11、12、13、14 和 15 个 mers 的最小表位。去除所有预测的组合物。所有的 mers 也都 netchop 运行，并确定了 2 个 3 的身体有 1 个改变了。为了过滤，应该筛选出一个体执行的步骤。一个网络收费标准的应删除图标；在 2 个（bBI、UCSC、Enember）中发现必须有数据库的注释，理由是必须更改本集的内容；保留的差异 225% 查出这个 GC 的出现在我们的列表中。
观察到 8000个过滤器的观察结果将是对 8000个过滤器的创建。 a) 外显子组通过 1, 0 = 是，否；(b) 1, 0 = 是看到，没有过滤器；(c) 基因表达四分暴露≥1、2、3、4；(d) netMHCpan3.0等级≤5、4、3、2、 1、0.75、0.50、0.25、0.1；(e) netCHOP Cterm 评分≥0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；(f) netCHOP 20S ≥0、0.1、0.2、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、；(g) 3个标准的0.09≥0、1、2、3、4、5。
考虑到大约 45 个过滤组合，分析所有的 2 个应用程序有 5 个应用程序适合哪一个，然后中到最多的每个过滤组分配给 25 个组。在的 25 个个体有观察到的按 eq 数据后，取 RNA-S 的结果的观察顺序，排列顺序，对降下的 25 个个体进行相同的处理。
TMG每个制造商（2223个），被认定为小分子的非变体RI构成为同义体，其1个是被WT的2个被排序的。Eco和BHI将TMG片pcRNA2SL中在制造体线性化后，进行苯酚-氯仿提取。并用乙酸钠和乙醇沉淀DNA。按照商家的指示，使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific）使用1 μg使用 LiCl 2 RNA 并生成简单的线性 RNA 。
肽由内部制造或从 GenScript 购买，简而言之，在补充有 800 IU/mL GM-CSF 和 800 U/mL IL-4 的 DC 细胞培养基0×以中。 0.5 10 6至1 × 10 6 个mL 的浓度收获、洗涤和重悬自体或同种异体 DC 。下层，细胞将在 37 ° C、5%CO 2中与肽之前 2 至 12 小时。共培养，收集 DC，用 PBS 洗涤两次，并重新提高在用于培养基中，然后共培养 50/50 个。
当DCs制作板T细胞靶标时，在96孔中使用3×10 4至1×10 5个细胞/孔。当细胞系制作靶T细胞时，96孔中使用2×10 4至T 细胞（1× 10 4个细胞/孔） 96 个孔板。在没有外源添加因子的情况下，所有细胞共培养一个均在 50 /50 母乳中进行佛板。12-肉蔻豆酸酯13-科学盐-分子筛(eBio) 波恩导电胶。在MultiScre-IP 萤石(MilliporeSigma) 上-γ ISPOT 。每个50μ70%乙醇/孔洞用超滤纯2分钟，用优质生物）4次，然后用10 μg/mL IFN-γ水板抗体（100 μL/孔板抗体，100 μL/孔白，： 1-D，Mabtech，在抗 C 中）3 共 4°PBS，在 CD 3 共 / 下mL 过夜。将抗体（OKT3，Miltenyi，1-1 μg 添加到当天左右的孔中。在每个，每个用板子洗涤30个左右，并在用30个PBS的IL-2的完整次播放过程中播放。分钟后5个底板共播放（18-2小时），支持并转移到细胞中 96 96式细胞染色和分析。所有 ELISPOT 板用含有 0.05% Tween-20 (MP Biomedicals) 的 PBS 5 次，并与 1 μg/mL、0.22-μm 的抗人过滤器 IFN-γ 检测抗体（长 7-B6-1 , Mabtech, 100 μL/5% FBS PBS 过滤器。每块板用和素板） 5 5 链霉霉-磷酸盐与磷酸酶（链磷酸钠-磷酸盐，用 100 μL/ PBS 磷酸酶吸收） 0.5 1:300 ddH -μm 和 2% 中间用 0.005% Tween 1 μg/mL、0.22 检测抗人干扰素过滤抗体（全长 7- B6-1abtech，100%，链MBS，100%链与PBS。（M链与PBS）板用PBS 5 5 5 5 5 洗涤亲和素-磷酸盐磷酸酯酶（Mabtech, 000 μL） /孔, 滤清器:3000 dd-15% FBS:3000 dd-15% FBS，小时用 dd 3 3 洗涤 3 05% Tween0 (MP Biomedical) 并加 1 μg/0.22-μm2 过滤抗人 IFN-γ检测试剂（链霉素7，100μl-B6-1M每个，100μL），链与PBS加0μ孔/5% FBS。板用PBS 5次洗涤霉菌抗体并亲和-素磷酸酶-磷酸酶（链霉素ALP） ) (M 100, 用 PBS, 然后 0dd 000 小时 μL 技术: 300 小时 1 小时, 用 PBS, 用 PBS 洗涤 3 次 3 次2O.45-μm 过滤的 K BCIP 底物溶液，1 μL/孔通过/N 0005分钟 1000 分钟 100 分钟板用100 分钟 100 分钟 100 分钟 100 分钟 10 分钟 100 分钟对接收的细胞CD134和CD137表面染色，并使用BD FACSCanto I、BD FACSCanto II 或BD LSR Fortessa 进行系统评估。使用FlowJo tessa (Tree Star)分析所有流式细胞仪数据。
使用 BD F F 激活板 (CD13、CD137) 细胞反应性 T 或四分选到聚合体聚合体 96 细胞聚合酶链反应 (RT-PCR) 细胞反应液中的2 次。套PCR反应（24）。使用One-PCR试剂盒（QIAGEN）进行PCR反应物，分别使用多个Vα和Vβ引区域和1个用于Cα和多个C区域的引物。根据制造的说明使用条件下进行 RT-PCR：50°C 15 分钟、95 分钟 2 分钟、95 分钟 15 和 605 分钟 4 分钟，重复第二个 C°C°C反应，使用 HotStarq DNA 聚合（和内部 QIA 的 CPCR 的 Vα 和多种 Vβ 类物质的 PCR 引出的物），将一个来自一个 4 μL 的 PCR 产物和第 1 个 α 和 25 μL 的内部产品区域替代。 （个秒、分钟引物的最终浓度为0.6 μM）。循环条件为95°C 15、94 °C 30 50°C 30 秒、72°C 1 分钟重复循环，52°C 10 分钟产品在通过 Sanger 类的 PCR 物进行精炼，并使用来自 Beckmann 的 Cα 和 Cβ 内部的产品。
TCR Vβ 受体基因是 SEQ、Adaptive Biotechology 对从外血 T 细胞和肿瘤组织中分开的细胞组进行的。通过基因组范围内的 T 细胞数量大约从 2 × 10 4到 1 × 10 6。使用 immunoSEQ Analyzer 3.0 分析 TCR B 链 (TRB)的长性和生产力。在 TCR 频率的计算中只使用了有效的 TCR 重排。
TCR 叉和 T 细胞转（14 , 22），TRA V J 编码序列与 TCRβ 编码序列与老鼠 TCRβ 不同的链编码 TRB VDJ 与小鼠 TCRɑ 序列不同的链（25）。不同的动物链，通过改变 TCRɑβ P 2 左右 TRA 25长。TRB 和链由弗林领导由 SGSG发起。
将自体或转种异体培养基解冻并在T细胞培养基同种中设置为2×10个6个细胞/mL，该培养基由RPMI和AIM-V培养基的50/50混合物组成，以内部人辅助血，10 μg/mL 庆大肌素）、100 U/mL 青霉素和 100 μmLro/2 mM l-谷5%细胞（均来自Life Technologies，Themo Fisher Scientific ）。在肿瘤细胞/mL 细胞可转导前，用肿瘤细胞 50 ng/mL 细胞溶化性 OKT3 (Miltenyi Bio/mL) 和 30 IU/mL2 (Chiron Corporation) in 24 (2 × 10 60/mL)封装。（2个新闻简报） （英文简报） 233GP 一天24天24新闻/g）的孔子1克1G（V包）。...） 1 × 10 6 239GP 到 1 × 10 6 239GP 孔洞的 6 孔多聚转板共赖亮 2000 （Life Technologies，Thermo Fisher Scientific）被包裹的。清液，培养基1:1 用 D 记忆，然后在 20 克离心到细胞有受话孔/细胞的连接，然后细胞（10μmL，Takara的6个孔/小时，每小时组织处理32克）。以 300 g 至300 g至300 g的 T 细胞培养基中 IL-2 的 T 细胞培养基 10 分钟将受刺激的T细胞转导预告，从板中转导，并在包含重组IL-2（含有细胞转导-2）的T细胞转导中包含进一步培养。GFP 和模拟转导控制。通常在 10 天左右对细胞进行转导后进行检测。
滴定定表面染色：CD3-AF70000000细胞（用于人）（CD4-来自人类） ), PE-Y7, APC-H7 (全SK, CD8-PE-H7, 1:100, (C33), OX40-PE-Cy7 (C5636666666666, 1:7+) 和 5553, 1:7Cy8 (C5553, 1:7C77) ）和1BB-APC（5508，1:7 ng/mL），30 ng（130-093-387 Miltenyi Biotec）的精制抗CD3。
所有外显子组和 RNA-Seq 数据都保存在 NCBI 的基因型和表型数据库 (dbGaP) (ID: phs001003.v1.p1)。
该研究是在 FDA 的 Investigator IND 下进行的，该方案得到了 NCI、NIH 的 IRB 的批准，并在 ClinicalTrials.gov 注册（NCT03480152）。所有患者都提供了知情书。
GC 设计了这项研究，进行了实验，分析了数据，并撰写了相关的手稿。JJG执行了与研究的所有生物信息学。B进行了细胞实验设计和数据分析。HLA执行所有外显子组数据组和SS 验证、RNA - Seq。SAR参与了研究设计、实验设计、结果手稿撰写了数据并监督了该作者的所有项目。
A. Mixon 和 S. Farid 提供流式细胞仪，感谢外科部门的其他成员提供支持，感谢我们提供的讨论支持。我们 NIH 的医学艺术服务部门进行图形编辑。我们感谢 Cognition Studio Inc. 制作与CI 工作相关的图形摘要。这个研究得到了美国国立卫生研究院 N 癌症研究中心的校内计划研究支持。
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利益相关方： TZ 是 Moderna 的员工，持有该公司的权益。在这段研究期间，K 是 Moderna 的一名员工。SAR、GC、NL 和 RY 是专利申请（编号 E-165-2020-0 -US-01）的发明人。
版权所有： © 2020，美国临床调查学会。
参考资料：J Clin Invest . 2020;130(11):5976–5988.https://doi.org/10.1172/JCI134915。
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