线粒体基因测序与全核基因测序的区别与联系

随着分子生物学和生物信息学的迅猛发展，DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，极大地推动了生物学的发展，这些新技术在很大程度上弥补了传统分类的不足，尤其是在区别亲缘关系比较近的种属方面发挥很大的作用。该技术的原理是：每个物种的DNA序列都是唯一的，DNA序列测序是分子系统学研究的工具^[1]在DNA序列上,每个位点都有A、T、G、C四种选择，由于自然选择，某些位点上的碱基是固定的，导致编码组合的减少，可以通过考虑蛋白编码基因来解决，在蛋白编码基因上的一条45个碱基序列就可以获得将近十亿种可选择的编码。从理论上来讲，建立在一段长度为几百个碱基的基因序列信息基础上的DNA条形编码技术完全可以包括所有物种，根据这个特点，在分类学上，根据对统一的目标基因DNA序列的分析完成物种鉴定^[2]。该技术的优点是：(1) DNA序列信息是数字化的，不受主观评判的影响。它可以在任何时间被使用不同语言的人去重复验证，可以说会是分类方面全球通用的交流工具；(2)可以鉴定生物的卵和幼体、动物或植物的寄生物，甚至根据动物肠道的包含物或排泄物分析食物链方面的问题；(3)可以解决形态学手段难以攻克的隐存种的问题；(4)随着分子生物学技术的不断发展，测序成本的下降，生物信息学的发展和完善，鉴定物种的速率会大大提高。

一、线粒体基因测序

线粒体DNA（mtDNA），也叫线粒体基因组，多数是环状结构，少数是线型结构。因物种的不同，线粒体基因组的大小也不相同，一般植物细胞中最大，也更复杂，100~2500碱基对（kb），动物细胞中比较小，约为10～39千个kb；哺乳动物的最小，约为16.5kb。线粒体基因组携带的基因数量并不多，迄今已知，它编码2种线粒体核糖体RNA（rRNA，12S及16S）、22种线粒体转运RNA（tRNA）和13种呼吸作用相关酶的亚基（每种约含50个氨基酸残基）。线粒体基因是裸露ＤＮＡ，分子结构简单，易突变，且遵循严格母系遗传，其进化速率约为单拷贝核DNA的5-10倍，从而成为研究群体水平和近缘种类之间关系的有力分子标记，被广泛应用于物种遗传和进化规律研究。线粒体基因在复制过程中相当保守，尤其是在细胞减数分裂期间不发生重排，只是位点突变率高，所以特别适合用做系统进化分析，有利于检查出物种间在较短时期内基因发生的变化，已经成为遗传进化研究中方便而得力的信息来源。且因精子细胞含有非常少的细胞质，使得雄性的线粒体DNA不能遗传给后代，而雌性卵细胞中的线粒体DNA则会传递给后代。因此，利用线粒体基因构建的进化树反映的是母系脉络的进化关系和种群进化史。每个细胞中就含有线粒体几十至几千个线粒体基因组，在自身更新复制过程中，即使出现复制错误或者变异，也会因为细胞中其他多个备份而在表型和功能上表现不出来。这样，经过一代代复制、遗传和筛选，有些有意义的变异就被保留并富集下来，最终形成了线粒体基因组单核苷酸变异的多态性（SNP）。这种隐藏的核苷酸变异情况，通过二代高通量测序技术，很容易被检测出来，线粒体基因组上携带的SNP能够被准确而高效地检测出来，可用于物种的测序，利用线粒体基因组，可以帮助人类理清家畜的起源以及种群迁移和扩张路径。随着二代高通量测序技术的完善，越来越多物种的线粒体基因组被深度测序，如人、灵长类（猴、大猩猩）、大型哺乳动物（非洲象、牛、羊、马）、鼠类、犬、猫、鸭嘴兽、鸟类（原鸡、绿头鸭），哺乳动物线粒体全基因组大小一般为15000bp-18000bp，各个编码基因之间存在很小的重叠和间隔，不同物种间各基因以固定顺序排列。在线粒体基因组中不同基因的进化速率也不同，２核糖体ＲＮＡ基因比较保守，13个编码蛋白基因进化速率相对较快，控制区基因进化速率最快，突变率最高，常被用来进行种群遗传结构分析和基因多样性方面的研究，尤其适合于进行较近亲缘关系种间、种内的系统分类研究^[3]，通过分析突变位点在线粒体基因组结构中的位置、对应的核酸和氨基酸特点和功能等信息，揭示物种或种群在进化过程中对自然环境或人工选择的适应和进化规律，线粒体DNA（mtDNA)是目前应用最广锭的分子系统地理学标记。

线粒体与核基因相比具有独特遗传特征，例如线粒体具有严格的母系遗传，缺乏重組，是中性的，且进化速率快^[3]，在昆虫中经常使用线粒体作为标记，而且线粒体中的很多基因位点都能使用通用引物轻易地扩增出来。虽然线粒体DNA在遗传学研究中占据了重要地位，但是线粒体DNA序列中的信息只能反映所考察的群体中的雌性成员的演化进程，而不能代表整个种群。这一缺陷需要由对父系遗传序列（如Y染色体上的非重组区）的测序弥补。广义上来说，只有既考虑了线粒体DNA信息、又考虑了核DNA信息的遗传学研究，才能为种群的进化史提供全面的线索。另一方面，相对于基因组而言，线粒体基因组能提供的信息还是有很大局限性，有很多参与线粒体功能的蛋白是由核基因编码、运输给线粒体的。但值得注意的是，在很多情况下（昆虫也不例外）线粒体DNA会与核基因组中的假基因发生重姐，或者通过父系渗漏引起的不同单倍型的双亲线粒体DNA发生重组，影响分析结果的可靠性^[3]，因此，必须将线粒体基因组与核基因组共同分析，才能为系统进化分析和揭示线粒体功能异常所导致的线粒体疾病提供正确的遗传学信息。

二、核基因测序

核基因中含有更加丰富的生物学信息，运用核基因序列或将核基因序列与线粒体基因序列相结合研究昆虫的系统发育正成为分子系统学领域的一种发展趋势。由于核基因没有线粒体基因的替代偏倚特征，两栖爬行动物分子系统学应该更加关注核基因数据而不是线粒体基因数据，当前运用核基因序列或基于线粒体DNA与核基因序列的联合数据研究两栖爬行动物的系统发育，渐渐成为该领域的新的发展趋势和必然。DNA多态现象广泛存在于真核生物中，并为研究进化机制提供了极好的机会。但是，在核DNA标记应用到分子系统学研究中，不得不面对很多挑战，包括重组、非中性选择、杂合性、插入/删除多态性、低度分歧、在速率和历史方面的基因特异变异，PCR以及测序的困难等一系列问题,这其中一些问题不在线粒体DNA分子标记中出现，只对核分子标记具有特异性。目前，虽然应用分子系统学研究的核基因数量较多，但能够适用于两栖动物分子系统学研究的核基因很有限^[1],核糖体基因中18SrDNA、28SrDNA、ITS已在昆虫分子系统学中得到了广泛的应用，与核糖体基因相比，虽然编码蛋白的核基因应用于昆虫分子系统学的种类不少，但大部分都是应用于双翅目和鳞翅目昆虫的分子系统学研究中，能够成功地普遍用于多个目昆虫的系统学研究的核基因并不多。表明核基因与线粒体基因相比有以下优点：1）核基因一般比线粒体基因进化得慢‚这使它们成为一种解决分歧久远的比较好的标记；2）核基因构建的树普遍有比较高的CI值‚与线粒体基因相比更有助于整棵树的解决；3）核基因的碱基位点速率变异有更高的同质性；4）核基因的碱基替代速率距阵比线粒体基因的要均匀。由于核基因没有线粒体基因的替代偏异特征，昆虫分子系统学应该更加关注核基因数据而不是线粒体基因数据^[4][4]，由于核不同的区段具有不同的进化速率，所以核是研究系统发育和进化很好的标一记。在核的序列中，应用不同的区段几乎可以进行任何距离的系统发育问题，另外，核序列中还存在有高度保守的区段可用来设计引物。

三、核糖体RNA基因测序

16S、18S、28S表明核糖体的沉降速度不同，“S”沉降速度代表沉降速度的度量，原核细胞及真核细胞内共生体的70S核糖体中包含3种沉降系数不同的rRNA，其中30S核糖体亚基中包含16S rRNA，50S核糖体亚基中包含5SrRNA和23S rRNA。这3种rRNA在结构上有明显的不同。即原核生物中则含23S、16S和5S三种rRNA。核糖体基因序列广泛用于昆虫系统发育与区系研究，因为的保守区域较多，可以用作设计引物，同时不同区域进化水平不同，可以用于不同分类等级的研究，核糖体基因结构既具有保守性又具有高变性，其保守性反映生物物种的亲缘关系，高变性则揭示生物物种的变异程度^[5]。

真核生物80S核糖体中包含4种沉降系数不同的rRNA，其中，40S核糖体亚基（小亚基）中包含18S rRNA，而60S核糖体亚基（大亚基）中包含5S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。即真核细胞核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S四种rRNA；真核细胞中的18S rRNA是16S rRNA的同源RNA，其相对分子质量约为0.7 MDa，长度约为1900 nt。18SrRNA除了比16S rRNA稍长且多一些臂和环结构外，两者空间结构十分相似，在核糖体中起到的作用也基本相同。核核糖体RNA基因（nrDNA）序列在昆虫分子系统学上的应用rRNA是构成核糖体的主要成分‚在细胞内含量很高‚约占总RNA的80％～85％。真核生物的nrRNA包括大小两个亚基。大亚基由主要为28S、5.8S和5SrRNA组成‚小亚基为18SrRNA，rRNA基因在真核生物基因组中以串联重复方式存在‚其中18S、5.8S的28SrRNA基因组成一个转录元‚产生一个前体RNA^[6]。

18SrDNA是指真核生物染色体上编码核糖体小亚基RNA，由18SrRNA基因在蛋白质合成中具有重要的功能，因此其基因序列及二级结构高度保守，一般认为它比较适合于研究高级阶元的系统发育。许多学者已经用18SrDNA序列研究昆虫的分子系统学^[6]‚所以就酵母而言，鉴定酵母菌株本身是需要进行18s鉴定，之所以酵母中同时出现了真核和原核的rRNA沉降系数，可能是因为该株酵母中含有共生体（线粒体，质体）。

28SrDNA是真核生物的染色体上编码核糖体大亚基的基因，同18SrDNA一样‚28SrDNA由于其重要的生物学功能‚在进化过程中比较保守‚但与18SrDNA相比‚变异性较大‚也是研究生物高级阶元系统发育较好的分子标记。在28SrDNA保守的序列中含有12个高变区（D1～D12）‚因此可用来解决从种到科水平上的系统发生关系）^[6]，在进化过程中同一样，总体上比较保守,但比变异较大,也是研究生物高级阶元系统发育较好的分子标记。保守的序列中含有个高变区一，可用来解决从种到科水平上的系统发生关系，该基因在分析软体动物属种间亲缘关系中同样被证实是非常有效分子标记之一。

16S rDNA测序技术：由于不同种的真细菌与古细菌间的16S rRNA基因（16S rDNA）是高度保守的，16S rRNA作为研究分类学和系统进化的分子受到很大重视，16S rRNA 基因普遍存在于细菌和古细菌中，具有多个拷贝数，全长 1500 bp 左右，其结构由 9 个可变区  (Variable region)  和 10 个保守区  (Conserved region)  交替组成 ，保守区有利于扩增引物的设计，可变区体现了物种间的进化差异。这些特性使 16S  rRNA 基因成为原核生物鉴定分类、系统进化以及多样性分析等研究中常用的分子标志物^[7]。16S rRNA序列分析是当前对细菌进行分类学研究中较精确的一种技术，随着分子生物学的快速发展以及该技术在医学微生物研究中的应用，对16S rRNA作为微生物分类依据的研究也逐渐发展起来并已得到广泛认同，目前，主要指基于高通量测序技术，完成16SrDNA部分或全部基因序列，用于解释样本中或样本组间物种分布、丰度、差异、进化等关系，利用 16S rRNA 基因序列分析能够鉴定到属或种的水平^[8]，①16S rRNA基因的序列有10个保守区和9个高变区（V1-V9：长度分布范围约30~100bp）之分。②保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。③根据保守区设计引物位点，扩增可变区获得的序列可以用于菌种鉴定。一种快速、廉价的菌种鉴定方法。④16S rRNA基因测序随后被发现能够将细菌分类到新种，甚至新属中。⑤用来描述从未被成功培养的新物种。①16s rRNA基因是核糖体翻译mRNA的亚基和必要部件，广泛存在于细菌和古菌中，其他常用Marker基因，并不是在所有活体微生物中存在。②16S rRNA基因包含高度保守区适合设计PCR通用引物，用于目标区域的扩增。V1-V3和V1-V4提供属水平测序解决方案，比其他区域更能获得精确的微生物物种注释和评估^[9]，16S rRNA 基因测序与宏基因组测序、代谢组学等多组学联用也将成为新趋势。16S rRNA 基因测序解析微生物群落结构，挖掘样本特征与群落特征的关联，宏基因组测序寻找重要编码基因或富集的代谢通路，而代谢组学进一步反应菌群生化功能在分子水平上的变化，这些研究方法相辅相成，克服了单一组学研究的局限性，微生物群落多样性的研究促进了环境科学和生态学的发展，也将在改善人体健康，提高作物产量，开发清洁能源等其他方面做出重要贡献^[7]。

参考文献

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